p55PIK在結(jié)直腸癌細胞增殖中的作用及其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 p55PIK調(diào)控DNA合成及細胞周期進程的Rb非依賴途徑的機制研究
　　目的：本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)在Rb陽性表達的細胞中，p55PIK能夠通過其N末端24個氨基酸（以下簡稱N24）與Rb結(jié)合，促進細胞向S期進程，干預(yù)p55PIK功能能夠使細胞周期停滯與G1/G0期，而在Rb缺失的細胞中，p55PIK也能夠調(diào)控細胞周期，但具體機制不明確。本部分研究旨在明確p55PIK在Rb缺失的

2、細胞中調(diào)控DNA合成及細胞周期進程的作用及其Rb非依賴途徑的機制。
　　方法：首先，利用實驗室前期構(gòu)建的高表達p55PIK的腺病毒（或轉(zhuǎn)染針對p55PIK的特異性siRNA片段），在Rb缺失的細胞（FTC236）中高表達（或者是低表達）p55PIK，通過BrdU摻入的方法檢測各組細胞 DNA的合成和細胞周期的分布，通過細胞計數(shù)的方法檢測細胞增殖；然后，構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型，檢測 p55PIK對Rb缺失的HT29（HT29Rb-

3、/-）細胞成瘤能力的影響；進一步，通過免疫組織化學(xué)方法（Immunohistochemistry，IHC）檢測了55例臨床結(jié)直腸癌患者正常組織和腫瘤組織中p55PIK蛋白水平的表達；然后，通過免疫熒光共定位（Immunofluorescence colocalization，IFC）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，IP）、pull-down等方法探討了p55PIK與細胞增殖核抗原（Proliferating

4、cell nuclear antigen，PCNA）之間的關(guān)系；最后，高表達p55PIK或利用N24干預(yù)p55PIK功能，通過定量免疫共沉淀（Quantitative co-immunoprecipitation，QIP）的方法檢測p55PIK對PCNA與DNA聚合酶δ（DNA polymeraseδ）之間結(jié)合的影響。
　　結(jié)果：過表達p55PIK能夠明顯促進腫瘤細胞DNA的合成及細胞向S期進程，進而促進細胞的增殖，而低表達p55

5、PIK能夠明顯抑制細胞DNA的合成并使細胞阻滯于S期，抑制細胞的增殖；p55PIK蛋白水平在結(jié)直腸癌腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)，高表達p55PIK能夠促進裸鼠皮下移植瘤的形成；p55PIK能夠通過與PCNA直接結(jié)合，促進PCNA與DNA聚合酶δ的結(jié)合，從而促進細胞DNA的合成，干預(yù)p55PIK的功能能夠抑制PCNA與DNA聚合酶δ的結(jié)合，從而抑制細胞DNA的合成。
　　結(jié)論：p55PIK在結(jié)直腸癌腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)。P55PIK能

6、夠通過其N末端24個氨基酸特異性與PCNA直接結(jié)合，促進PCNA與DNA聚合酶δ的結(jié)合，促進細胞DNA的合成，從而促進腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤的發(fā)生。
　　第二部分 p55PIK在結(jié)直腸癌中表達調(diào)控的轉(zhuǎn)錄后機制研究
　　目的：前期已經(jīng)證明了p55PIK在結(jié)直腸癌腫瘤中呈高表達狀態(tài)，高表達p55PIK能夠通過促進細胞DNA的合成及細胞周期進程促進細胞增殖，并進一步明確了其機制。本部分旨在探討p55PIK在結(jié)直腸癌中高表達的轉(zhuǎn)錄

7、后調(diào)控機制。
　　方法：在結(jié)直腸癌細胞中轉(zhuǎn)染miR-148b的模擬物（mimics）或者是抑制子（inhibitor）通過western blot和real-time PCR方法檢測p55PIK的表達，同時通過BrdU/PI摻入法檢測其對細胞周期和DNA合成的影響，通過細胞計數(shù)方法檢測其對細胞增殖的影響；構(gòu)建 miR-148b的高表達和低表達穩(wěn)定細胞系（LoVo細胞），并以此穩(wěn)定細胞系構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，體內(nèi)實驗檢測miR-1

8、48b對結(jié)腸癌細胞成瘤能力及p55PIK表達的影響；構(gòu)建p55PIK的3’端非編碼區(qū)（3’Untranslated region，3’-UTR）的雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒，檢測miR-148b的mimics或inhibitor對其活性的影響；突變miR-148b與p55PIK的3’-UTR結(jié)合位點，再檢測miR-148b對其熒光素酶報告基因活性的影響；最后，通過“rescue”實驗檢測 miR-148b對細胞周期和 DNA合成的影響是否依

9、賴于p55PIK。
　　結(jié)果：高表達miR-148b能夠抑制p55PIK蛋白水平的表達，但對其mRNA沒有明顯影響，抑制結(jié)直腸癌細胞DNA的合成，并使細胞停滯于G0/G1期；而低表達miR-148b能促進p55PIK蛋白水平表達，促進細胞DNA合成和細胞周期進程；miR-148b能夠直接與p55PIK的3’-UTR結(jié)合，發(fā)揮對p55PIK的調(diào)控作用；體內(nèi)高表達miR-148b能夠明顯抑制結(jié)直腸癌細胞的成瘤能力而低表達 miR-14

10、8b能夠明顯促進結(jié)直腸癌細胞的成瘤能力；并能調(diào)控體內(nèi)p55PIK的表達。高表達p55PIK能夠逆轉(zhuǎn)miR-148b對結(jié)直腸癌細胞DNA合成和細胞周期調(diào)控的作用。
　　結(jié)論：miR-148b能夠通過直接作用于p55PIK的3’-UTR，抑制p55PIK蛋白水平的表達，抑制結(jié)直腸癌細胞DNA的合成和細胞周期進程，從而抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和成瘤能力；miR-148b調(diào)控細胞周期和細胞增殖的功能依賴于p55PIK。
　　第三部分

11、miR-148b在結(jié)直腸癌中表達調(diào)控的機制
　　目的：前面已經(jīng)明確了p55PIK在結(jié)直腸癌中對細胞增殖的作用及機制，并進一步探討了在結(jié)直腸癌細胞中miR-148bp調(diào)控55PIK表達及功能的機制，但是，miR-148b在結(jié)直腸癌中表達調(diào)控的機制尚不明確，本部分旨在明確miR-148b在結(jié)直腸癌中表達調(diào)控的機制。
　　方法：首先，通過生物信息學(xué)分析miR-148b啟動子活性區(qū)結(jié)構(gòu)，找到調(diào)控miR-148b表達調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子p5

12、3；在結(jié)直腸癌細胞中轉(zhuǎn)染高表達p53的質(zhì)粒或低表達p53的siRNA，通過real-time PCR方法檢測其對miR-148b表達的影響；構(gòu)建miR-148b上游啟動子活性區(qū)域的雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒質(zhì)粒，檢測p53對其活性的影響；通過點突變技術(shù)將p53與miR-148b可能結(jié)合的位點進行突變，檢測p53對突變后的miR-148b啟動子活性區(qū)熒光素酶活性的影響；分析miR-148b啟動子上游與p53可能結(jié)合的位點并設(shè)計染色質(zhì)免疫共沉淀

13、（Chromatin Immunoprecipitation，Chip）引物，通過Chip方法驗證p53與miR-148b啟動子區(qū)的關(guān)系。
　　結(jié)果：在結(jié)直腸癌中高表達p53能夠明顯促進miR-148b的表達，低表達p53能夠明顯抑制miR-148b的表達；高表達p53能夠明顯促進miR-148b啟動子熒光素酶報告基因活性，但對突變后的miR-148b啟動子活性卻沒有明顯影響，低表達p53能夠明顯抑制miR-148b啟動子熒光素酶

14、報告基因活性，但對突變后的miR-148b啟動子活性卻沒有明顯影響；p53能夠與miR-148b啟動子區(qū)直接結(jié)合。
　　結(jié)論：在結(jié)直腸癌細胞中，p53能夠通過與miR-148b啟動子區(qū)直接結(jié)合，增強miR-148b啟動子活性，促進miR-148b的表達。
　　第四部分 p53通過miR-148b調(diào)控p55PIK的表達
　　目的：前面已經(jīng)明確了miR-148b在結(jié)直腸癌細胞中調(diào)控p55PIK的表達及具體機制，還證明了p5

15、3對miR-148b表達的調(diào)控及機制。本研究部分將探討p53能夠通過miR-148b調(diào)控p55PIK的表達。
　　方法：首先，在結(jié)直腸癌細胞中轉(zhuǎn)染高表達p53的質(zhì)?；虻捅磉_p53的siRNA，通過western blot和real-time PCR方法檢測了p55PIK蛋白水平和mRNA水平的表達；然后，在結(jié)直腸癌細胞中高表達p53的同時抑制miR-148b的表達，或低表達p53的同時高表達miR-148b，檢測p55PIK蛋白水

16、平的表達；進一步，檢測了本實驗室保存的8株結(jié)直腸癌細胞中p53、miR-148b及p55PIK的表達，觀察其是否具有相關(guān)性；最后，檢測了臨床結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和正常組織中p53、miR-148b以及p55PIK的表達情況，明確三者在臨床樣本中的表達相關(guān)性。
　　結(jié)果：在結(jié)直腸癌細胞中高表達p53能夠抑制p55PIK蛋白水平的表達，但是對其mRNA水平卻沒有明顯的影響；低表達p53能夠明顯促進p55PIK蛋白水平的表達，但是對其m

17、RNA水平卻沒有明顯的影響。高表達p53的同時低表達miR-148b能夠恢復(fù)p53對p55PIK蛋白水平的抑制作用，而低表達p53的同時高表達miR-148b能夠抵消p53對p55PIK蛋白水平的促進作用；在8株結(jié)直腸癌細胞中，p55PIK高表達的細胞系，miR-148b呈低表達狀態(tài)，對應(yīng)的p53蛋白水平呈明顯低表達甚至缺失或存在功能缺失的突變；臨床樣本中，p55PIK在腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)，而miR-148b呈低表達狀態(tài)；在新取的9