松江鱸(Trachidermus fasciatus)抗氧化相關(guān)基因的克隆表達(dá)與功能分析.pdf

1、松江鱸是一種典型的降海洄游性魚(yú)類(lèi)。歷史上，松江鱸分布范圍較廣。但是，隨著環(huán)境污染的加劇，松江鱸賴(lài)以生存和繁衍的生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重的破壞，現(xiàn)已被列入國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。人工養(yǎng)殖成為恢復(fù)其自然種群的重要途徑和手段，然而，松江鱸魚(yú)獨(dú)特的生物學(xué)和生理學(xué)特性，決定了它與其他魚(yú)類(lèi)不同的病理、病癥特點(diǎn)。面對(duì)養(yǎng)殖過(guò)程中日益嚴(yán)重的病害問(wèn)題，深入開(kāi)展松江鱸免疫機(jī)制研究，并在此基礎(chǔ)上尋找松江鱸疾病防治的有效方法已成為當(dāng)務(wù)之急。研究表明，生物體在受到病原和重金屬等

2、刺激時(shí)，因氧化應(yīng)激體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)。ROS在殺滅入侵的病原微生物的同時(shí)，由于其反應(yīng)的非特異性，也會(huì)對(duì)宿主的細(xì)胞、組織和器官造成嚴(yán)重傷害，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體生理機(jī)能的損傷和免疫系統(tǒng)的破壞。所以，消除生物體內(nèi)因過(guò)度免疫反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)量ROS將能夠增強(qiáng)其抗病能力，有效地保護(hù)免疫器官和組織，抑制免疫細(xì)胞的凋亡，提高免疫力。
　　 硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)和過(guò)氧化物還原

3、酶(Peroxiredoxin，Prx)分別屬于生物體內(nèi)非酶抗和酶抗氧化劑，在清除ROS過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本論文采用RACE(RapidamplificationofcDNAends)技術(shù)從松江鱸體內(nèi)克隆到了硫氧還蛋白1（TfTrx1）、硫氧還蛋白相關(guān)蛋白14(Thioredoxinrelatedprotein14，TfTRP14)和過(guò)氧化物還原酶1(TfPrx1)三種與免疫系統(tǒng)相關(guān)的抗氧化基因，分析了它們的分子結(jié)構(gòu)特征，采用實(shí)時(shí)熒光

4、定量PCR(QuantitativerealtimePCR，qRT-PCR)檢測(cè)了三個(gè)基因的組織分布及LPS和重金屬刺激后的表達(dá)模式變化;同時(shí)，將三個(gè)基因連接到pET-30a(+)載體，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的重組表達(dá)。獲得純化蛋白后，制各多克隆抗體，利用Westernblot檢測(cè)了LPS刺激后蛋白水平表達(dá)譜變化，并對(duì)蛋白活性進(jìn)行了檢測(cè)。
　　 Trx是一種廣泛存在于生物體的具有氧化還原活性的酸性小分子蛋白質(zhì)。松江鱸Trx1（TfT

5、rx1）cDNA全長(zhǎng)為665bp，包括5'端非編碼區(qū)39bp，3'端非編碼區(qū)290bp，開(kāi)放閱讀框336bp，編碼111個(gè)氨基酸。TfTrx1預(yù)測(cè)分子量為12.34kD，理論等電點(diǎn)(pI)為4.52。TfTrx1不含信號(hào)肽，與裸蓋魚(yú)的同源性為66％，序列中含有高度保守的活性位點(diǎn)序列CGPC(Cys-Pro-Asp-Cys)。二級(jí)結(jié)構(gòu)含有5個(gè)β折疊和4個(gè)α螺旋，TfTrx1蛋白結(jié)構(gòu)與人類(lèi)Trx1結(jié)構(gòu)非常吻合。通過(guò)Neighbor-join

6、ing方法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，松江鱸Trx與裸蓋魚(yú)等魚(yú)類(lèi)Trx1首先聚在一起，然后與其他脊椎動(dòng)物Trx1聚為區(qū)別于Trx2的一大支，從而也證明我們克隆到的是松江鱸Trx1基因。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TfTrx1在血、心、肝臟、鰓、胃、腸、皮膚、肌肉、腎、脾、腦、卵均有表達(dá)。LPS刺激后皮膚、肝臟、脾、和腦中TfTrx1轉(zhuǎn)錄水平存在明顯的上調(diào)。在蛋白水平，皮膚和肝臟中，LPS刺激后TfTrx1的上調(diào)表達(dá)比mRNA水平的上調(diào)持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間。

7、重金屬刺激組，在所有檢測(cè)的組織（皮膚、肝臟、脾、鰓和腦）中，TfTrx1均在刺激后24h上調(diào)至最高峰。為進(jìn)一步探討其生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了TfTrx1重組質(zhì)粒，獲得了純化重組蛋白。熒光活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TfTrx1蛋白二硫鍵的還原能夠?qū)⑸彼岬臒晒鈴?qiáng)度提高近2.6倍，這暗示色氨酸殘基周?chē)h(huán)境的變化。胰島素二硫鍵還原酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TfTrx1蛋白在體外具有還原酶的活性，且活性具有一定的濃度依賴(lài)性。這說(shuō)明TfTrx1在生理?xiàng)l件下，可作為一種

8、氧化還原酶，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程。LPS作用實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TfTrx1可以與LPS直接結(jié)合發(fā)生相互作用。細(xì)菌結(jié)合和凝集實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TfTrx1可能通過(guò)與LPS的作用而導(dǎo)致其具有結(jié)合和凝集革蘭氏陰性菌的活性。這暗示TfTrx1可能在抵抗LPS對(duì)組織、器官損傷，促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬作用等機(jī)體免疫防御中發(fā)揮作用。
　　 TRP14是具有Trx樣活性中心的硫氧還蛋白超家族成員。松江鱸TRP14(TfTRP14)cDNA序列全長(zhǎng)945bp，開(kāi)放閱

9、讀框?yàn)?72bp，編碼由123個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。蛋白的預(yù)測(cè)分子量為14.11kD，理論等電點(diǎn)(pI)為5.45，沒(méi)有信號(hào)肽。多序列比對(duì)結(jié)果顯示TRP14具有高度保守的活性位點(diǎn)序列CPDC(Cys-Pro-Asp-Cys)，TfTRP14與裸蓋魚(yú)序列同源性高達(dá)90％。二級(jí)結(jié)構(gòu)含有5個(gè)β折疊和4個(gè)α螺旋，TfTRP14蛋白結(jié)構(gòu)與人類(lèi)TRP14結(jié)構(gòu)非常吻合。與TfTrx1相比，TfTRP14活性位點(diǎn)周?chē)ㄒ粋€(gè)延伸的α2-β2環(huán)和一個(gè)α3

10、a折疊區(qū)，這可能會(huì)導(dǎo)致兩種蛋白底物的特異性。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，TfTRP14在各個(gè)組織均有表達(dá)，但是表達(dá)量高低具有組織特異性。LPS和重金屬刺激后，TfTRP14表達(dá)存在明顯上調(diào)，表明TfTRP14可能參與到松江鱸機(jī)體對(duì)微生物和重金屬的免疫防御中。為了驗(yàn)證TfTRP14生物學(xué)活性，利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得TfTRP14重組蛋白，活性二硫鍵的還原能夠顯著的提高色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度，但是胰島素二硫鍵還原酶活性顯著的低于TfTrx1，可能由于

11、TfTRP14與TfTrx1具有不同的氧化還原特點(diǎn)，因而使底物具有一定的差異性所致。
　　 由于絕大部分過(guò)氧化物還原酶在體內(nèi)以硫氧還蛋白作為惟一的氫供體，因此又被稱(chēng)為硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶。松江鱸Prx1(TfPrx1)的cDNA序列全長(zhǎng)1047bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?00bp，編碼199個(gè)氨基酸。TfPrx1預(yù)測(cè)分子量為22.35kD，理論等電點(diǎn)為6.42。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，TfPrx1含有Prx特征肽段“FYPLDFTFVCPTEI

12、”和“GEVCPA”，屬于典型的2-Cys型Prx。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示松江鱸Prx與其他物種的Prx1聚在一起，區(qū)別于Prx2分支，這證明我們克隆到的是松江鱸Prx1基因。TfPrx1在檢測(cè)的各個(gè)組織中都有表達(dá)，其中以腸中表達(dá)最強(qiáng)，其次為腦，而在肝臟和肌肉中的表達(dá)較弱。LPS和重金屬刺激后，TfPrx1在主要免疫器官和腦中均明顯上調(diào)表達(dá)，表明TfPrx1可能在抗氧化應(yīng)激相關(guān)的機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用。該基因的原核重組表達(dá)蛋白在DTT存在的條件