柞蠶防御基因defense的克隆、表達與功能分析.pdf

1、免疫反應分為兩個分支，先天性免疫和獲得性免疫,昆蟲不具備哺乳動物那樣完善的獲得性免疫系統(tǒng),因此先天免疫就成為了其抵抗病原微生物入侵的主要手段，而昆蟲的先天免疫又分為細胞免疫和體液免疫兩大部分，二者共同作用抵御病原物的侵染。細胞免疫包括吞噬、集結和包囊等作用類型，同時體液免疫主要包括黑色素形成和抗菌肽產生兩種機制。柞蠶是一種重要的野生絹絲昆蟲，主要分布區(qū)域分別在亞洲國家，具有可以作為紡織工業(yè)原料利用的價值，而且具備很高的藥用和食用經濟價值

2、，因此，對柞蠶先天免疫防御相關基因的研究對于提高柞蠶抗病能力具有重要的理論意義，此外，也可以推進鱗翅目其他昆蟲相關研究，從而進一步為鱗翅目病蟲害的防治提供借鑒。
　　利用分子生物學和生物信息學方法對柞蠶defense基因進行分析研究，得到的主要研究成果有以下幾點：
　　1．ApDef基因的克隆及序列分析：
　　通過實驗克隆出ApDef基因的 cDNA序列，總長677bp，包括編碼163個氨基酸的開放閱讀框（ORF），以

3、及5’端非編碼區(qū)(5’UTR)和3’端非編碼區(qū)(3’UTR)分別為63bp和122bp。預測蛋白分子量約為17 kDa，理論等電點為4.74；該蛋白屬于親水性蛋白，有明顯的信號肽，沒有明顯的跨膜結構域，且亞細胞定位在線粒體或其它部位的可能性很小，位于胞外的可能性最大。構建的系統(tǒng)進化樹顯示柞蠶與天蠶親緣關系最近，與哺乳動物人和小鼠的距離較遠。
　　2. ApDef基因的表達分析：
　　提取柞蠶五齡時期不同組織總RNA，設計特異

4、性引物，進行了實時熒光定量PCR（QRT-PCR）。實驗結果顯示，選取的組織表達量有明顯差異，在脂肪體中表達量最高，血細胞和中腸中有微量表達，表皮中不表達。
　　PCR擴增柞蠶ApDef基因的ORF，連接到pET-28a(+)表達載體，并且轉入大腸桿菌 BL21(DE3)菌株中，用 IPTG進行了不同濃度的誘導表達，用SDS-PAGE電泳和 Western blot方法檢測驗證，表明被誘導的目的蛋白均得到了穩(wěn)定的表達。用IPTG進