固定化β-葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖工藝研究.pdf

1、龍膽低聚糖(gentio-oligosaccharides)是一類新型的功能性低聚糖,具有顯著增殖腸內有益菌、調節(jié)腸內菌群平衡和改善通便效果等生理功能。為了降低龍膽低聚糖的生產成本,為其工業(yè)化生產提供技術參數,本文研究了固定化β-葡萄糖苷酶(IBGL)制備龍膽低聚糖的工藝,通過葡聚糖凝膠柱層析分離得到了目的物,并采用電噴霧質譜和核磁共振氫譜對其進行了鑒定。主要研究結果如下:
　　 1.BGL的制備工藝:黑曲霉固態(tài)發(fā)酵,按料液比1

2、:10,自然環(huán)境溫度下用pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液浸提3次,浸提率可達93.82%:硫酸銨兩步鹽析法純化BGL,純化倍數為1.6倍。
　　 2.IBGL的制備工藝:質量分數為3.5%的海藻酸鈉水溶液10mL與2mL適度稀釋的酶液充分混合(加酶量為105U/g干載體),加入1%(v/v)的戊二醛,4℃交聯3h,滴入2%的氯化鈣溶液中硬化12h,所得IBGL凝膠球的酶活為17.78U/g濕凝膠,硬度為658.32g,本工藝的酶活

3、回收率為66.34%。
　　 3.IBGL的性質:IBGL的最適反應pH為4.8,最適反應溫度為65℃,米氏常數Km值為1.07mmol/L。BGL和IBGL對葡萄糖的轉化率分別為47%、43%。與BGL相比,IBGL的耐受pH范圍、最適溫度和穩(wěn)定性都有所提高。
　　 4.IBGL固定床反應制備龍膽低聚糖工藝:60%(w/v)的葡萄糖緩沖溶液,加酶量為30U/g葡萄糖,pH4.8,溫度65℃,轉化36h,間歇反應4次。平

4、均葡萄糖的轉化率為41.07%,IBGL的剩余酶活為82.23%。IBGL,的生產能力約為BGL的3.50倍。
　　 5.產物龍膽低聚糖的分離鑒定:
　　 1)分離條件:葡聚糖ShephadexG-10凝膠柱Φ1cm×40cm,10%乙醇洗脫,流速10mL/h,柱溫50℃。產物經分離后得到了兩個組份,TLC鑒定組份Ⅰ為葡萄糖,組份Ⅱ可能為生成的龍膽二糖。
　　 2)組份Ⅱ鑒定:ESI-MS測定其相對分子質量與龍膽

5、二糖相同;1H-NMR(400MHz,D2O)δ:5.06,5.05,3.85～3.65,3.60～3.50,3.38～3.25,3.20～3.00。結合質譜、核磁共振氫譜結果,判定組份Ⅱ為龍膽二糖。
　　 6.酶法合成龍膽低聚糖體系中殘留底物葡萄糖量的方法學研究:為定量測定酶法合成龍膽低聚糖得率,本文采用葡萄糖試劑盒法,通過測定轉化后殘留底物葡萄糖的量,間接測定龍膽低聚糖得率。該法在2小時內測定酶法合成龍膽低聚糖體系中葡萄糖量