蜂毒肽與基因變構IL-2融合蛋白在畢赤酵母中的表達、純化及生物學活性研究.pdf

1、目的構建融合基因蜂毒肽(melittin)與人變構白介素2[M-IL-2(88Arg,125Ala)]畢赤酵母分泌型表達載體pPICZα A/M-IL-2(88Arg，125Ala)，轉化畢赤酵母菌GS115。篩選多拷貝陽性菌株，甲醇誘導多拷貝陽性菌株表達融合蛋白，分離純化該融合蛋白，并進行抗菌及抗腫瘤生物學活性研究。
　　方法以質粒pET-15 b/M-IL-2(88Arg，125Ala)為模板，PCR獲得目的基因，構建重組載體

2、pPICZα A/M-IL-2(88Arg，125Ala);通過電轉法轉化畢赤酵母GS115;MMH，MDH篩選Mut+表型陽性菌株GS115; ZeocinTM梯度法及熒光定量PCR法篩選多拷貝轉化酵母菌株。陽性轉化子經甲醇持續(xù)誘導表達，提取上清，SDS-PAGE及BCA法檢測最佳誘導時間，Western blot鑒定抗原性及特異性。經硫酸銨分級沉淀法、透析法、鎳離子親和層析純化融合蛋白;液相測定法研究融合蛋白抑菌活性，CCK-8法檢

3、測該融合蛋白抗腫瘤活性。
　　結果成功構建畢赤酵母陽性轉化菌株GS115/M-IL-2(88Arg，125Ala)。經MDH及MMH篩選出Mut+型重組菌株GS115/M-IL-2(88Arg，125Ala)。ZeocinTM梯度法及熒光定量PCR法成功篩選出兩株多拷貝轉化酵母菌株。SDS-PAGE檢測在26kDa左右有明顯目的條帶，與理論值相符。BCA法測定甲醇誘導120h融合蛋白表達量達到最高濃度814.5 mg/L，遠遠高于

4、該融合蛋白存原核系統(tǒng)中產量。Western blot鑒定該融合蛋白具有抗原特異性。經硫酸銨分級沉淀法、透析法、鎳離子親和層析法獲得純度為99％的目的蛋白，經濃縮管濃縮獲得濃度為432.5mg/L的目的蛋白5 mL。經檢測純化的融合蛋白具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長活性，具有較強抑制人卵巢癌細胞SKOV3細胞及Hela的生長增殖的生物活性。
　　結論成功構建畢赤酵母分泌表達重組載休pPICZα A/M-IL-2(88Arg，