白喉毒素-IL-2融合蛋白的基因構建及其表達、純化的研究.pdf

1、東南大學碩L學位論文摘要1喉毒素(DiphthreiatoxinDT)是由感染0噬菌體的白喉桿菌所產(chǎn)生的外毒素，毒性極強，它通過滅活真核細胞的肚鏈延伸因子II，阻斷蛋白合成，導致細胞死亡。近年來白喉毒素被廣泛用于制備各種腫瘤導向藥物。白細胞介素2(1L2)主要由T細胞或T細胞系產(chǎn)生?，F(xiàn)己證明。許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤細胞，如成人T細胞白血病、毛細胞白血病、皮膚T細胞淋巴瘤等，表達高親和力IL2受體，且表達量顯著高于正常細胞。這種IL2受體的

2、顯著差異及受體與配體的特異性結合，為殺傷腫藥物的定向導入提供了可能。崢于上述機理)我們構建了DT3s9IL2重組嵌合毒素，它保留了白喉毒素N端的389個氨基酸(跨膜區(qū)和酶活性區(qū))，用人全長IL2替換了白喉毒素受體結合區(qū)。依賴于白喉毒素蛋白分子結構上的特點，重組嵌合毒素DT3s9IL2包括三個有活性的功能區(qū)。即白喉毒素酶活性區(qū)、跨膜區(qū)及人IL2。其作用機制是分子中的IL2與細胞表面的IL2受體特異性結合，形成受體一配體復合物，然后通過跨膜

3、區(qū)結構的改變來介導毒素內化，內化后的毒素蛋白分子，在胞內酸性環(huán)境的作用下發(fā)生斷裂，釋放白喉毒素酶活性區(qū)至胞漿中發(fā)揮毒性作用，從而特異性地殺滅IL2高表達的腫瘤細胞。乙實驗首先應用PCR技術分別擴增編碼白喉毒素N端389個氨基酸的DNA片段(DT3s9)和人白細胞介素2全長編碼基因:將PCR擴增的目的基因產(chǎn)物分別克隆到pUC18載體上，再用相應的限制性內切酶NdeISph1BamHI等切下，將它們拼接到pET3a原核表達載體上，得到pET

4、3aDT389IL2，測定基因序列正確。隨后，用pET3aDT3s9IL2原核表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導目的蛋白表達。確定蛋白表達的最適條件為:37℃培養(yǎng)至OD600約0.6，加入IPTG至終濃度為1mmoUL，繼續(xù)誘導培養(yǎng)35h。傳代100代篩選出穩(wěn)定表達株，表達量17%以上，經(jīng)超聲破菌及SDSPAGE電泳確定目的蛋白為可溶性表達。經(jīng)SDSPAGE電泳鑒定了目的蛋白的分子量為58kD，與文獻報道一致。Wes

5、temblot表明目的蛋白與白喉毒素多克隆抗體及人IL2多克隆抗體均有很好的免疫反應性，證明其中同時含有白喉毒素和人IL2成分，確認其為DTvsvIL2東南大學碩士學位論文ABSTRACTDiphtheriatoxin(DT)isasinglechainexotoxinof535amionacidssecretedbycorynebacteriophagediphtheriaecarryingDTgene.Ithasstrongtoxi

6、cityandonlyoneortwomoleculescankillacell.Sothetoxinarewidelyusedinthestudiesontargetingdrugs.Inlertenkin2(IL2)isapleiotropiccytokinewhichmainlybesecretedbyTcelllymphocytes.Onthecellsurfaceofsometumorssuchaschroniclymphoc

7、yticleukaemiacutaneousTcelllymphoma(CTCL)thereceptorsofIL2havebeendemonstratedbeingataveryhighlevel.ForthisreasonselectivecytotoxicityagainstIL2receptorbearingcellscouldbeusefulintumortargetingtherapy.Basedonthisstrategy

8、weconstructedachimericmoleculefusingIL2withtheenzymaticdomainandtransmembranedomainofDT(namedDT389).ThemechanismbywhichDT389IL2killacellisthatonceIL2moleculesbindtotheirreceptorsoncellsurfacethetransmembranedomainwilltra

9、nslocatetheenzymaticdomainintothecytoplasm.ThentheenzymaticdomaincatalysesthetransferoftheADPrebosylgroupofNADtoelongationfactor2(EF2)asaconsequenceEF2isinactivatedandtheproteinsynthesisofthesensitivecellisheldbackTomake

10、thehybridmoleculeofDT389IL2thefragmentsofbothtruncateddiphtheriatoxin(containingthe389aminoacidsofNterminusDT389)andfulllengthhumanIL2geneswereamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)proceduresrespectivelyandthenwereclone

11、dseparatelyintopUC18vector.Afteridentificationbyrestrictenzymem叩pingandsequencingDT389andIL2cDNAwerelinkedtogetherandtheninsertedintoprokaryoticexpressionvectorpET3atheresultedvectorwasnameaspET3aDT3s91L2.SecondlythepET3

12、aDT3s9IL2wastransformedintoEcolistrainBL21(DE3).RecombinantDT389IL2wasexpressedsuccessfullyusingIPTOtoinducethetranscriptionT7promoterstheexpressionlevelcouldreachup18%ofthetotalbacterialprotein.AspredictedSDSPAGEanalysi