鼠傷寒沙門菌乙?；孜锏暮Y選及Lrp乙?；揎椪{(diào)節(jié)其功能的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括磷酸化、糖基化、泛素化和乙?；?。蛋白質(zhì)乙?；揎椫饕l(fā)生在賴氨酸殘基上，是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。從1964年首次發(fā)現(xiàn)乙?；揎椧詠恚谡婧松锖驮松镏性絹碓蕉嗟囊阴；鞍妆昏b定到，并且發(fā)現(xiàn)乙?；瘏⑴c轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，細(xì)胞代謝等一系列生命活動。
　　原核生物的乙?；芯恐饕性诖竽c桿菌和沙門菌，通過抗體免疫富集技術(shù)結(jié)合高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，鑒定到了非常多的乙?；鞍?。在沙門菌細(xì)胞內(nèi)已發(fā)現(xiàn)CobB和Pat分別行使

2、蛋白質(zhì)去乙?；鸵阴；饔谩４送?，細(xì)胞代謝物乙酰磷酸(AcP)也可以化學(xué)催化方式對蛋白質(zhì)進(jìn)行乙?；揎?，但對底物缺乏專一性。因此，我們希望通過細(xì)菌雙雜交的方式篩選直接與CobB和Pat相互作用的蛋白，以發(fā)現(xiàn)更多的乙?；揎椀鞍?。
　　本研究首先構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌(Salmonella enerica serovar Typhimurium)的基因組DNA文庫，然后用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)，在報(bào)告菌株中共轉(zhuǎn)化文庫質(zhì)粒和pUT18-pat或p

3、UT18-cobB，利用藍(lán)白選擇篩選與Pat和CobB相互作用的蛋白，然后用Western blot檢測篩選到蛋白的乙酰化水平以及是否受Pat/CobB/AcP的調(diào)控。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過細(xì)菌雙雜交篩選，我們獲得了12個與CobB或Pat有相互作用的蛋白。隨后驗(yàn)證了5個蛋白(Lrp、NrdF、RhaR、1074、FliT)，發(fā)現(xiàn)除FliT外，其他4個蛋白均存在乙?；揎?。有意思的是這4個蛋白顯示不同的Pat/CobB/AcP乙

4、酰化修飾機(jī)制。其中Lrp(leucine-responsive protein)是沙門菌的全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠正向調(diào)控或負(fù)向調(diào)控很多基因和操縱子的表達(dá)，包括參與氨基酸的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，菌毛的合成以及沙門菌的毒力等。
　　為進(jìn)一步對Lrp的乙?；揎椆δ苓M(jìn)行深入研究，我們將Lrp N端HTH結(jié)構(gòu)域“識別螺旋”上的K36突變?yōu)镼（模擬乙?；嚢彼幔┗騌（模擬去乙?；嚢彼幔?，表達(dá)純化后用EMSA(凝膠遷移實(shí)驗(yàn))檢測突變體與受Lrp調(diào)節(jié)

5、的fimZ基因啟動子的結(jié)合能力。之后通過在△lrp中回補(bǔ)Lrp的野生型和36位賴氨酸模擬乙?；耐蛔凅w，并用qPCR檢測下游基因的表達(dá)。Western blot顯示Lrp K36受到Pat和AcP的乙?；揎?。EMSA結(jié)果表明Lrp的K36突變后對fimZ啟動子的結(jié)合能力降低?；匮a(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，Lrp K36模擬乙酰化抑制下游基因的表達(dá)。
　　綜上所述，我們在鼠傷寒沙門菌中共鑒定到12個直接與Pat或CobB有相互作用的蛋白，Lrp的