CTGF-整合素-FAK信號通路在肝纖維化中的表達變化以及肝復康的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 肝纖維化是慢性肝臟疾病發(fā)展為肝硬化甚至肝癌的漸進性病理過程，是肝臟在多種損傷因素作用下發(fā)生的慢性代償性修復反應。肝纖維化的發(fā)生機制比較復雜，涉及到細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的相互作用，并且有多種細胞因子參與。因此，肝纖維化的分子生物學機制一直是研究的熱點內(nèi)容之一。
　　 結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是一種多功能的分泌性多肽，可以調(diào)節(jié)細

2、胞增殖、分化以及黏附等生物學活性，在組織損傷修復、細胞外基質(zhì)合成等方面發(fā)揮重要作用。研究證實，CTGF在肝纖維化中發(fā)揮促進纖維化發(fā)生發(fā)展的正調(diào)節(jié)作用。整合素是存在于肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)等細胞表面的受體蛋白，近年研究發(fā)現(xiàn)CTGF可以通過與整合素受體結(jié)合調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號通路的活性。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是整合素信號通路中重要的細胞因子，激活后可以進一步啟

3、動下游一系列細胞信號級聯(lián)反應。目前，CTGF促進肝纖維化的分子生物學機制還未完全明了，CTGF/整合素/FAK信號通路與肝纖維化的關系也尚無明確報道。
　　 傳統(tǒng)中藥在慢性肝臟疾病治療中取得了一定的療效，復方中藥肝復康在治療肝纖維化等慢性肝臟疾病中能夠發(fā)揮有效成分豐富、生物學靶點多樣等優(yōu)點。本課題組已有研究發(fā)現(xiàn)肝復康能夠明顯改善肝功能、抑制炎癥反應和延緩纖維化的進展過程。然而肝纖維化的發(fā)生機制中有多種細胞因子以及多條細胞信號通路

4、參與，因此，肝復康的治療肝纖維化的分子機制仍需完善。
　　 本研究的目的在于:
　　 第一，觀察CTGF/整合素/FAK信號通路中CTGF、整合素α5β1、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、FAK、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、核糖體S6蛋白激酶（ribosomal protein S

5、6 kinase，P70S6K）等關鍵蛋白分子在肝纖維化中的表達變化，探討CTGF/整合素/FAK通路在肝纖維化中的作用;
　　 第二，觀察肝復康對CTGF/整合素/FAK信號通路在肝纖維化中表達的影響，進一步研究肝復康治療肝纖維化的分子生物學機制。
　　 方法:
　　 采用皮下注射CCl4法復制肝纖維化動物模型:將50只SD大鼠隨機分為5組，分別為正常對照組、模型組、肝復康大、中、小劑量治療組，每組10只。除正

6、常對照組外，其余各組大鼠皮下注射以橄欖油稀釋的10％CCl4(5ml/kg)，每周2次，正常對照組只注射同等體積的橄欖油;在肝復康大、中、小劑量治療組，從注射CCl4后第9周開始，分別每天給予肝復康(3125 mg/kg、312.5 mg/kg和31.25mg/kg)灌胃，至第20周結(jié)束。
　　 乙醛刺激法激活體外培養(yǎng)的HSCs:將傳代培養(yǎng)的HSCs隨機分為三組，分別為正常對照組:在含10％正常對照組血清的DMEM細胞培養(yǎng)基上常

7、規(guī)培養(yǎng);模型組（乙醛刺激）:在含10％正常對照組血清的DMEM細胞培養(yǎng)基中加入乙醛（終濃度200μmol/L）;肝復康治療組（乙醛刺激+肝復康含藥血清）:在含10％的肝復康藥物血清DMEM細胞培養(yǎng)基中加入乙醛（終濃度200μmol/L）。
　　 應用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、免疫組織化學(IHC)以及免疫蛋白印跡(Western-blot)方法，檢測各組大鼠肝組織中以及各組HSCs中CTGF/整合素α5β1/FAK

8、信號通路中關鍵細胞因子的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.CTGF、纖連蛋白和整合素α5β1在肝纖維化中的表達及肝復康的干預作用
　　 RT-PCR、Western-blot和免疫組化法觀察大鼠肝組織中CTGF、整合素α5、整合素β1以及纖連蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，肝纖維化模型組中各指標的表達在mRNA水平和蛋白水平均有明顯提高(P＜0.01);而在肝復康治療組中，CTGF、整合素α5、整合

9、素β1以及纖連蛋白的表達量比模型組明顯下降(P＜0.01)。
　　 體外培養(yǎng)的HSCs中，乙醛刺激激活的HSCs模型組中，CTGF、整合素α5、整合素β1以及纖連蛋白的mRNA表達水平比正常對照組明顯升高(P＜0.01);而經(jīng)過肝復康含藥血清作用后，與模型組相比，各指標的基因表達量明顯下降(P＜0.01)。
　　 2.FAK/Akt信號通路在肝纖維化中的作用以及肝復康的調(diào)節(jié)
　　 與正常對照組相比，肝纖維化模型組

10、大鼠肝組織P-FAK和P-Akt的表達顯著增多(P＜0.01);肝復康治療組中二者的磷酸化程度與模型組相比，有明顯下降(P＜0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示，模型組的大鼠肝組織α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA) mRNA表達水平與正常對照組相比明顯增高（P＜0.01）;肝復康治療后大鼠肝組織α-SMA mRNA表達量較模型組明顯減少（P＜0.01）。
　　 正常對照組HSCs表達少量的FA

11、K，Akt以及α-SMA mRNA;模型組HSCs上述基因表達水平比正常對照組明顯升高（P＜0.01）;肝復康含藥血清治療組HSCs表達FAK，Akt以及α-SMA mRNA水平比模型組明顯下降(P＜0.01)。
　　 3.mTOR/P70S6K信號通路與肝纖維化的關系以及肝復康的抑制作用
　　 mTOR、P70S6K、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA在正常對照組中表達量很少;而在模型組中，以上指標的表達水平明顯上調(diào)，比正常對

12、照組明顯增多（P＜0.01）;在肝復康治療組中，肝復康明顯下調(diào)了各指標的mRNA表達水平，與模型組相比，明顯降低(P＜0.01)。與正常對照組相比，模型組大鼠肝組織cyclinD1 mRNA和蛋白的表達水平均有明顯升高（P＜0.01）;而肝復康治療后，二者合成量較模型組明顯減少(P＜0.01)。
　　 正常對照組HSCs中，mTOR、 P70S6K、cyclinD1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達量極少;而乙醛刺激的HSCs模型

13、組中，以上細胞因子的基因表達量比正常對照組明顯增多(P＜0.01);肝復康含藥血清作用后的HSCs與模型組相比，上述指標的表達水平顯著下降（P＜0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 1.CTGF/整合素α5β1/FAK信號通路的激活促進了實驗性大鼠肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　 2.體外培養(yǎng)HSCs的激活、增殖與CTGF/整合素α5β1/FAK信號通路的活化有關。
　　 3.肝復康通過抑制CTGF/整合素α5β1