巨噬細胞及GM-CSF對大鼠DIEP皮瓣成活影響的實驗研究.pdf

1、腹壁下動脈穿支(DIEP)皮瓣作為穿支皮瓣的代表，在最近的十幾年中得到了廣泛的臨床應用。目前，DIEP皮瓣已經(jīng)超過TRAM皮瓣成為自體組織乳房再造的首選術式。DIEP皮瓣再造乳房的優(yōu)點是擁有充足的組織量，腹壁皮膚的色澤、質(zhì)地與受區(qū)十分相似，再造的乳房外觀、顏色與手感均較滿意；皮瓣血管蒂較長，十分有利于皮瓣塑形，且腹壁下動脈的口徑與胸廓內(nèi)動脈及胸背動脈的口徑相當，利于血管吻合；DIEP皮瓣乳房再造的最大優(yōu)勢體現(xiàn)在供區(qū)的并發(fā)癥發(fā)生率下降，該

2、技術保留了腹直肌前鞘及大部分腹直肌，減少了術后腹壁疼痛、薄弱、腹壁膨出和腹壁疝的發(fā)生率，最大程度地保護了供區(qū)，使患者獲得外形美觀效果的同時保留了供區(qū)的功能，此外手術恢復時間亦縮短。但DIEP皮瓣乳房再造仍然存在并發(fā)癥，人們享有其優(yōu)勢的代價是不僅增加了手術的復雜性，而且因為人為減少了腹直肌肌皮穿支的數(shù)量，從而減少了皮瓣的血供，理論上增加了皮瓣部分壞死和脂肪液化的幾率。如何提高乳房再造中DIEP皮瓣的成活率，是整形外科和腫瘤外科面臨的一道難

3、題。 當前促進皮瓣成活的研究聚集在以血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)為代表的各種細胞因子的研究上。目前普遍認為VEGF是一種最重要的血管生成因子，在治療性血管生成中具有重要意義。但是，以VEGF為代表的多種生長因子在病理性血管生成中同樣發(fā)揮著重要作用。腫瘤學研究表明VEGF是目前所知作用最強、選擇性最高的內(nèi)皮細胞絲裂原，是腫瘤血管生成中的重要調(diào)節(jié)因子，在許多實體腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移中起著極為重要的作用。我們認為，通過基因治療的方法將具有

4、潛在的促進腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的VGEF用于乳癌術后乳房再造的患者以促進再造乳房皮瓣成活是不合適的。 重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)已應用于臨床多年，是乳腺癌病人輔助化療時的常規(guī)用藥。在乳腺癌治療的臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)，因化療造成的白細胞低于正常的患者在接受rhGM-CSF治療后術區(qū)原本愈合不良的創(chuàng)面會很快愈合，所以我們設想是否單核/巨噬細胞抑或GM-CSF存在促進皮瓣血管生成的作用?文獻顯示：近幾年研究GM-CS

5、F促進創(chuàng)面愈合的報道比較多，而且絕大部分獲得了積極的結果。但將GM-CSF直接應用于皮瓣，觀察其對皮瓣成活影響的研究很少。因此我們將GM-CSF及過繼巨噬細胞用于乳房再造常規(guī)應用的DIEP皮瓣模型中，研究其對皮瓣成活的影響，具有特殊的臨床意義。 本實驗的第一部分研究了大鼠腹部皮瓣的結構特點，并改進了rat-DIEP皮瓣的制作過程，不解剖腹直肌，僅在腹直肌前鞘層面選擇穿支血管并切斷其它血供，形成DIEP皮瓣，在手術時間縮短的同時，

6、使模型具有更好的穩(wěn)定性和可重復性。第一部分實驗中我們成功建立了穩(wěn)定的rat-DIEP模型，并形成了相對簡單、容易推廣的操作流程。使rat-DIEP可以作為常規(guī)模型進行皮瓣成活的實驗研究。模型形成后，我們通過大體觀察及HE染色后的組織學檢查記錄了皮瓣成活的進程。通過免疫組化以VWF作為血管內(nèi)皮的識別標志，檢測皮瓣各個時點的微血管密度(MVD)的變化，應用苦味酸天狼猩紅染色及偏振光顯微圖像定量分析技術檢測皮瓣內(nèi)膠原含量，并描繪出在無干預情況

7、下rat-DIEP皮瓣形成過程中MVD及膠原含量與各時點之間的變化關系。 第二部分實驗的目的是研究GM-CSF以及巨噬細胞(Mφ)對大鼠皮瓣成活的影響。我們應用大鼠腹腔直接灌洗的方法，經(jīng)過分離、純化獲得大鼠Mφ。實驗中將模型動物分為四組，分別于皮瓣皮下應用重組大鼠GM-CSF，GM-CSF聯(lián)合過繼大鼠Mφ，過繼大鼠Mφ及生理鹽水。術后第7天取皮瓣標本，進行皮瓣成活面積的測定，以及免疫組化MVD檢測，Masson染色檢測皮瓣組織內(nèi)

8、膠原含量?；罨腗φ可分泌100多種物質(zhì)，其中包括大量細胞因子，可直接誘導新生血管生長。從理論上來說，Mφ應該具有促進皮瓣成活的治療作用，但是，我們的實驗結果顯示過繼的Mφ沒有增加大鼠皮瓣的成活比率。在皮瓣內(nèi)MVD檢測中，單純應用Mφ干預皮瓣成活的T組皮瓣MVD高于對照組，但無統(tǒng)計學意義。在皮瓣膠原含量檢測中我們發(fā)現(xiàn)，單純應用Mφ干預組膠原含量明顯低于對照組(p<0.05)，這可能因為Mφ過量激活金屬蛋白酶導致膠原分解過程延長的結果。與

9、其相反，應用GM-CSF組及其聯(lián)合應用Mφ組皮瓣成活率高于對照組(p<0.05)，其皮瓣MVD和膠原含量均明顯高于對照組(p<0.001)。 第二部分實驗得到的結論是：重組大鼠GM-CSF及其聯(lián)合過繼的大鼠Mφ皮下注射能夠提高大鼠DIEP皮瓣的成活率；并且能夠明顯提高術后第7天大鼠DIEP皮瓣的MVD及膠原含量。過繼大鼠Mφ單獨應用不能明顯提高大鼠DIEP皮瓣的成活率。 第三部分實驗的目的是探討重組大鼠GM-CSF及其與

10、過繼大鼠Mφ聯(lián)合應用促進大鼠DIEP皮瓣成活的分子機制。本實驗中，我們利用RT-PCR技術檢測第二部分實驗中各組動物皮瓣內(nèi)的多項基因表達，包括EMMPRIN、MMP2、TIMP1、Collagen I、Collagenlll、EGF、TGF—β1、VEGF、EGFR及VEGFR等。比較它們在各組皮瓣中的表達情況，從基因水平探討GM-CSF及其聯(lián)合Mφ促進皮瓣成活的機理。實驗結果顯示，應用GM-CSF組皮瓣EMMPRIN、MMP2、Col

11、lagen I、EGF和EGFR基因表達高于對照組；聯(lián)合應用GM-CSF+Mφ組皮瓣EMMPRIN、MMP2、TIMP1、Collagen I、CollagenlII、EGF、TGF-β1和EGFR基因表達高于對照組；應用Mφ組皮瓣EMMPRIN、MMP2、TGF-β1和EGF基因表達高于對照組。這些基因的上調(diào)從分子水平解釋了實驗組大鼠皮瓣成活率提高的原因。 綜上所述，本實驗研究的結論認為大鼠DIEP模型是一個穩(wěn)定可靠的皮瓣研究