牛成肌細胞高效表達啟動子的篩選鑒定.pdf

1、牛肉具有蛋白質高、脂肪低、膽固醇低等營養(yǎng)優(yōu)勢,并且富含人類所需要的所有必需氨基酸和部分主要微量元素,正逐漸成為人類的主要肉類消費品。隨著人們對牛肉性狀、質量和營養(yǎng)上要求的提高,通過轉基因技術繁育培養(yǎng)出具有優(yōu)良性狀的肉牛成為當今研究的熱點?？紤]到轉基因的安全性,組織特異性啟動子作為解決安全性問題的有力工具受到人們的重視。因此,在轉基因肉牛的研究中,肌肉高效特異性啟動子的研究具有重要意義。本研究旨在通過基因重組技術構建真核表達載體,利用轉錄

2、因子結合位點分析和序列對比合成啟動子和選擇增強子,以期獲得牛肌肉高效特異性啟動子。
　　 應用PCR方法擴增牛骨骼肌alpha-actin、MyIpf和Ckm基因5'調控區(qū)片段,在質粒pGL3-Basic的多克隆位點插入基因片段構建真核表達載體,脂質體技術轉染魯西黃牛成肌細胞和成纖維細胞,利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)比較alpha-actin、MyIpf,Ckm啟動子的活性。以牛骨骼肌alpha-actin啟動子轉錄起始位點前

3、82bp和148bp片段為核心啟動子,用合成的調控序列和核心啟動子分別構成兩個合成啟動子,將兩個核心啟動子和兩個合成啟動子分別插入pGL3-Basic載體中構建成真核表達質粒;根據鼠肌肉肌酸激酶Ckm增強子位置和序列,經過序列比對和轉錄因子結合位點分析,在牛肌肉肌酸激酶5'調控區(qū)內找到有一段與鼠Ckm增強子相似的序列,為了驗證該序列是否具有增強子的作用,將該序列分別連入合成啟動子前構建成真核表達質粒。通過脂質體技術轉染魯西黃牛成肌細胞和

4、成纖維細胞,利用雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)來檢測合成啟動子和增強子的活性。
　　 轉染成肌細胞后,alpha-actin啟動子活性較MyIpf和Ckm的活性高,轉染成纖維細胞后,三種啟動子的活性與空載體pGL3-Basic的相當,初步證實了以上三種啟動子的肌肉特異性。兩段核心啟動子轉染成肌細胞后均有活性,可作為核心啟動子進行后期的合成啟動子的構建;合成啟動子轉染成肌細胞后,合成的啟動子調控元件可使82bp核心啟動子活性提高大約1

5、40-400倍,使148bp核心啟動子活性提高大約2-3倍,且以82bp為核心啟動子構建的合成啟動子活性是alpha-actin啟動子活性的4-6倍,但是以148bp為核心啟動子構建的合成啟動子活性低于alpha-actin啟動子的活性;增強子活性分析結果為,該序列可使合成啟動子活性提高大約1-3倍,初步證明該序列具有增強子的作用,且連有增強子的82bp和148bp合成啟動子其活性分別是alpha-aetin啟動子活性的9-11倍和2-

6、3倍,其中連有增強子的82bp合成啟動子活性約是CMV活性的1/6;將含有合成啟動子和增強子的質粒轉染成纖維細胞,活性分析結果與其在成肌細胞中的相當,初步說明合成的啟動子和增強子缺乏細胞特異性。
　　 本實驗比較了天然存在的肌肉特異性啟動子的活性,得到了一個活性較高的合成啟動子,且在牛肌肉肌酸激酶5'調控區(qū)找到了一段具有增強子作用的序列。本實驗得到的合成啟動子和增強子為提高外源基因在牛肌肉中高效表達提供了實驗材料,為牛肌肉高效特