初免加強免疫增強肺炎鏈球菌表面黏附素(psaA)核酸疫苗免疫原性研究.pdf

1、肺炎鏈球菌是導致細菌性肺炎、菌血癥、腦膜炎等侵襲性疾病的重要原因,同時也是導致急性中耳炎和鼻竇炎的主要病原菌。由于抗生素的廣泛運用,已導致多種耐藥菌的產(chǎn)生。已經(jīng)用于臨床的預防疫苗主要為23價多糖疫苗和7價多糖蛋白結合疫苗,但前者是T細胞非依賴性抗原,對免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的2歲以下嬰幼兒以及老年人的保護性有限;后者包含的血清型有限,而且生產(chǎn)成本高,不適合在我國大范圍應用。
　　 PsaA是肺炎鏈球菌毒力因子之一,屬于金屬結合脂蛋白

2、家族成員,分子量為37-kDa,有309個氨基酸殘基構成,其氨基酸序列和免疫原性高度保守,屬于ABC-型轉運蛋白,PsaA在ABC型轉運體系中屬于細胞膜外蛋白質(zhì),一項功能是負責結合金屬錳離子和鋅離子;另一項功能是肺炎鏈球菌的一種黏附素。
　　 本研究根據(jù)基因庫中肺炎鏈球菌表面黏附素的基因序列(序列號U53509),設計引物,運用PCR法從肺炎鏈球菌基因組中克隆出psad基因,回收PCR產(chǎn)物并對其進行酶切,將其分別插入到pVAX1

3、真核表達載體和pET28a原核表達載體,分別構建出表達PsaA的核酸疫苗pVAX1-psaA及其重組原核表達載體pET28a-psaA,并對它們進行鑒定。將pET28a-psaA轉化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)ITPG誘導,采用鎳柱親和層析法純化PsaA蛋白,Western-blot分析其抗原性。
　　 10只BALB/c小鼠隨機分為實驗組和對照組,將構建正確的核酸疫苗pVAX1-psaA對BALB/c小鼠(n=5)進行3次核

4、酸疫苗免疫,隔周免疫一次,共3次,為初免,第三次免疫2周后,腹腔免疫50μg組PsaA純化蛋白。對照組僅隔周免疫3針100μgpVAX1空載體,加強免疫50μl生理鹽水。所有動物分別于0、2、4、6、7周尾靜脈取血,間接ELISA法測定其抗PsaA抗體水平。
　　 本實驗結果表明我們成功克隆出psaA基因并實現(xiàn)其亞克隆;所構建的psaA核酸疫苗序列正確,同時成功實現(xiàn)了PsaA蛋白純化;動物實驗結果表明核酸疫苗初免后蛋白加強組的抗