豬Nangog基因在成纖維細胞與克隆胚胎中的過表達研究.pdf

1、Nanog是在早期胚胎發(fā)育和干細胞多能性維持中起到關鍵作用的基因之一。在大型哺乳動物中,有關Nanog基因功能的研究甚少。原因之一是目前為止仍未建立起真正的胚胎干細胞系并且缺乏類似在小鼠和人胚胎干細胞中對相關轉錄因子的細致研究。豬是人類重要的疾病模型和器官供給者,對豬的研究不僅對畜牧業(yè)的發(fā)展有很大的促進作用,而且對醫(yī)學的研究也起著至關重要的作用。因此,在豬上對干細胞多能性基因的功能探索便顯得尤為重要。本研究通過遺傳修飾的方法,從豬MⅡ期

2、卵母細胞的RNA中克隆了與多能性維持緊密相關的轉錄因子Nanog的全長cDNA,并將其導入豬胎兒成纖維細胞,獲得了過表達Nanog的細胞系,之后利用轉基因的供核細胞構建出克隆胚胎并加以研究,試圖對豬Nanog基因功能進行初步探索。經(jīng)過實驗得到了以下研究成果:
　　 (1)本研究通過RT-PCR方法從豬MⅡ期卵母細胞總RNA中克隆了豬Nanog基因全長cDNA,序列分析表明該段基因由915個核苷酸堿基組成,與NCBI上豬Nanog

3、編碼序列進行BLAST比對分析同源性達98％,只有第562位堿基發(fā)生了錯義突變(A→G)和572位堿基突變(G→A),編碼氨基酸分別由天冬氨酸(Asp)突變?yōu)樘K氨酸(Thr),天冬酰胺(Asn)突變?yōu)樯彼?Ser)。
　　 (2)成功構建了pEGFP-C1/Nanog和pcDNA3.1(+)/Nanog真核表達重組質粒,在脂質體介導下轉染皮膚成纖維細胞,分別獲得穩(wěn)定轉染和瞬時轉染的細胞,免疫熒光結果表明Nanog蛋白可成功表達

4、于成纖維細胞核內。
　　 (3)對表達GFP-NANOG融合蛋白的細胞,熒光鑒定結果表明無論是穩(wěn)定或是瞬時表達的GFP-NANOG融合蛋白均位于細胞核內。
　　 (4)轉染有pEGFP-C1/Nanog和pcDNA3.1(+)/Nanog重組質粒的豬胎兒成纖維細胞在G418篩選多天后均有若干干細胞樣克隆形成。
　　 (5)豬胎兒成纖維細胞瞬時過表達Nanog基因后可瞬時激活Oct4,C-myc和Sall4至5倍,

5、2倍和5倍。
　　 (6)豬胎兒成纖維細胞瞬時過表達Nanog可瞬時激活JAK/STAT3通路(LIF,LIFr,Gp130)和下游激活基因(Stat3,C-myc)。
　　 (7)經(jīng)懸浮培養(yǎng),穩(wěn)定表達Nanog的成纖維細胞能形成典型的類胚體,RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)這些類胚體表達三個胚層分化標志基因。
　　 (8)經(jīng)過G418篩選的穩(wěn)定表達Nanog的體細胞,并不能維持多能性和信號通路相關基因的激活狀態(tài)。
　

6、　 (9)核移植實驗結果發(fā)現(xiàn)未進行轉染的成纖維細胞和分別穩(wěn)定轉染pcDNA3.1(+)空載體、pcDNA3.1(+)/Nanog載體的成纖維細胞所構建的克隆胚胎在卵裂率、融合率、囊胚率上差異不顯著,說明表達多能性轉錄因子Nanog的成纖維細胞與未經(jīng)遺傳修飾成纖維細胞所構建的克隆胚胎具有同樣的發(fā)育潛能.
　　 (10)在克隆胚胎中高表達的Nanog基因可以在桑葚胚期激活內源Oct4,Sox2和Nanog基因表達至159,93,和