Wnt16基因CRISPR-CAS9敲除對斑馬魚骨骼發(fā)育影響的初步研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是一種以低骨量為特征，并導(dǎo)致骨折風(fēng)險增加的骨組織微體系結(jié)構(gòu)退化的疾病。近十年來，大量的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWASs)、meta分析等表明wnt16基因上的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)突變與BMD相關(guān)，在小鼠敲除模型中也有證實(shí)。但wnt16在體內(nèi)調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育的分子機(jī)制尚不清楚，尤其是在胚胎發(fā)育早期。本研究采用分子遺傳學(xué)手段，利用CRISPR基因編輯技術(shù)在斑馬魚中敲除wnt16基因，為研究wnt16對斑馬魚骨骼發(fā)育的影響、揭示wn

2、t16調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。通過建立wnt16敲除斑馬魚模型，對于骨質(zhì)疏松癥藥物的開發(fā)與篩選也具有重要意義。
　　為了提高打靶效率，本研究同時注射兩個靶位點(diǎn)gRNA到0-1個細(xì)胞水平的斑馬魚胚胎。受精后50h檢測發(fā)現(xiàn)此次注射具有有效性。F0代斑馬魚成魚經(jīng)剪尾提取基因組進(jìn)行T7E1酶切分析和基因型分析鑒定了4種突變型斑馬魚。將這些F0代突變型斑馬魚分別與野生型雜交獲得F1代胚胎，在F1代成魚中共篩選到5種不同突變型斑馬魚。

3、TA克隆及測序結(jié)果顯示wnt16(21)F1和wnt16(7)F1這兩種突變品系的斑馬魚沒有產(chǎn)生移碼，只改變部分氨基酸序列，用Phyre預(yù)測其蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其二級結(jié)構(gòu)中的一個α螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。將同種基因型的雄性和雌性斑馬魚雜交得到F2代胚胎，在wnt16(21)F2中已鑒定到純合突變的雌魚。對wnt16(21)F2和wnt16(14)F2用阿爾辛藍(lán)進(jìn)行軟骨染色，發(fā)現(xiàn)wnt16(21)F2中存在Meckel's cartilage