布魯氏菌中CRISPr-Cas9基因編輯技術研究.pdf

1、布魯氏菌病是由革蘭氏陰性菌布魯氏菌引起的人畜共患慢性傳染病，主要引起家畜流產(chǎn)、睪丸炎，人感染后會出現(xiàn)波浪熱、關節(jié)炎，慢性患者會喪失勞動能力，給畜牧業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失也極大地危害著人類的健康。目前，沒有安全可靠的人用布病疫苗，畜用布病疫苗使用最廣泛的是弱毒活疫苗，但普遍存在毒力強、免疫時效短、易感染孕畜、干擾血清學免疫診斷等問題。布魯氏菌的胞內生存機制以及致病機制還不清楚，不產(chǎn)生內毒素，依靠其毒力基因完成其胞內生存與繁殖機制。隨著分子

2、生物學技術的發(fā)展，布魯氏菌毒力基因缺失疫苗有望成為控制布病疫情的新型安全有效的基因疫苗，成為了當下布病疫苗的研究熱點。目前，布魯氏菌基因缺失疫苗都是采用傳統(tǒng)的同源重組技術對布魯氏菌的毒力基因進行缺失，但是由于同源重組技術自身的局限性，限制了其在實驗研究中的發(fā)展。
　　近年來，一種新型、高效的基因編輯技術，CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠進行精確高效的基因敲除或者修飾，已經(jīng)廣泛應用于動植物等真核生物以及部分原核生物如大腸桿菌、根瘤農(nóng)桿

3、菌等細菌的基因編輯。到目前為止，該基因編輯系統(tǒng)還沒有在布魯氏菌中進行基因編輯的報道。本研究的目的是探究CRISPR-Cas9技術在布魯氏菌中進行基因編輯的應用情況，為布魯氏菌基因功能研究提供平臺，也為開拓更高效、便捷的布魯氏菌毒力基因編輯技術提供理論基礎。
　　在本研究中，我們首先驗證了表達CRISPR-Cas9系統(tǒng)基本元件（pBBR1復制子、pcat啟動子）在布魯氏菌中是否能夠正常表達。通過構建載體質粒驗證了泛宿主pBBR1復制

4、子及pcat啟動子在布魯氏菌中可以正常發(fā)揮作用。之后，我們將CRISPR-Cas9系統(tǒng)構建于載體質粒中，驗證了Cas9蛋白在布魯氏菌中可以正常表達，并且可以切割布魯氏菌基因組使布魯氏菌致死。由于布魯氏菌中缺乏非同源末端連接修復機制，因此將同源修復序列亞克隆至CRISPR-Cas9表達載體中，同時，為了克服質粒殘留帶來的鑒定干擾問題，以及防止DNA污染以及抗性基因引入帶來的生物安全問題，將自殺基因sacB基因亞克隆至CRISPR-Cas9

5、表達載體中，至此，基因敲除同源修復自殺質粒構建完成，將該質粒轉化至布魯氏菌感受態(tài)中，利用10％蔗糖進行質粒消除后，利用PCR技術、測序鑒定待檢缺失株都為假陽性，都為‘escapers’。
　　1、以質粒pBBR1MCS-5為載體骨架，以pBBR1為復制子，以質粒pZK001-szk001為模板克隆pcat啟動子、rmB T1 terminator、大腸桿菌ColE1復制子，以質粒pET28a為模板克隆lacI基因，構建誘導型穿梭載

6、體質粒。以pXG-10sf質粒為模板克隆lacZ&gfP基因，利用酶切酶連方法連接到載體上，以gfP為報告基因檢測誘導型pcat啟動子在布魯氏菌中的表達情況。
　　2、以質粒pZK35為模板克隆cas9基因的CDS以及sgRNA骨架，利用酶切酶連技術將CRISPR-Cas9元件連接至載體質粒中，以布魯氏菌國際標準株16M基因組為模板，利用生物學軟件設計布魯氏菌hfq基因的sgRNA dimer，利用酶切酶連方法連接至誘導型表達CR

7、ISPR-Cas9質粒上，分別將表達CRISPR-Cas9-sgRNA(targeting hfq)質粒、CRISPR-Cas9-sgRNA(nonspecific)質粒轉化至16M布魯氏菌感受態(tài)細胞中，檢測CRISPR-Cas9在布魯氏菌中能否發(fā)揮有效的基因編輯功能。Western blot結果顯示Cas9蛋白在布魯氏菌中能夠正常表達，轉化結果顯示Cas9蛋白能夠切割布魯氏菌基因組。
　　3、以質粒pK18mobSacB為模板克

8、隆sacB基因，然后以布魯氏菌國際標準株16M基因組模板克隆靶基因hfq的上下游同源臂，分別利用酶切酶連、Infusion技術將靶基因的同源修復序列、sacB基因，構建至誘導型CRISPR-Cas9表達載體中，構建完整的基因敲除同源修復自殺質粒。利用電轉化方法將該質粒轉化入布魯氏菌16M布魯氏菌感受態(tài)細胞，利用終濃度為1mmol/L的IPTG誘導CRISPR-Cas9的表達進行靶基因的切割，最后利用終濃度為10％蔗糖將質粒消除。利用PC