鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A增強(qiáng)氟康唑抗生物膜型白念珠菌的研究.pdf

1、目的：本研究旨在評(píng)價(jià)鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A(cyclosporine，CSA)對(duì)氟康唑抗生物膜型白念珠菌的增敏作用，并初步探討其增敏作用的可能機(jī)制。
　　方法：收集2014年1-12月從寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床血流感染標(biāo)本中分離出的白念珠菌，采用法國(guó)梅里埃公司全自動(dòng)微生物分析儀(VITEK2COMPACT)將微生物鑒定到“種”水平。選取從臨床血流感染分離的強(qiáng)產(chǎn)膜菌株CA NX05作為實(shí)驗(yàn)菌株，構(gòu)建體外生物膜模型，并分析其生長(zhǎng)動(dòng)力

2、學(xué)情況，明確菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期；采用熒光染色法定性觀察生物膜的生長(zhǎng)及形態(tài)，XTT法測(cè)定藥物對(duì)生物膜型白念珠菌細(xì)胞活性的影響，并利用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)耐藥及粘附相關(guān)基因ALS3、HWP1、CDR1、MDR及ERG11在mRNA表達(dá)水平的變化；利用水-烴兩相分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞表面相對(duì)疏水性的影響；利用流式細(xì)胞儀測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的影響。
　　結(jié)果：2014年1-12月從寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床血流感染標(biāo)本中共分

3、離出白念珠菌24株，其中4株強(qiáng)產(chǎn)膜菌株、6株中產(chǎn)膜菌株、14株弱產(chǎn)膜菌株，并將其中從臨床血流感染中分離獲得的強(qiáng)產(chǎn)生物膜型白念珠菌，命名為CA NX05（OD值最大）；用顯微鏡觀察結(jié)晶紫染色后的弱產(chǎn)膜株，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞以酵母樣粘附于培養(yǎng)板底部，并且形成微菌落，只有少量成菌絲樣細(xì)胞生長(zhǎng)。觀察CA NX05強(qiáng)產(chǎn)膜株時(shí)發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)胞是以菌絲樣生長(zhǎng)，菌絲相互交錯(cuò)生長(zhǎng)，依稀能看見(jiàn)基底的酵母樣細(xì)胞。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明4-18h是菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，當(dāng)

4、培養(yǎng)到24-48h時(shí)處于穩(wěn)定期。根據(jù)棋盤(pán)法藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，單用CSA對(duì)白念珠菌生物膜的抑制率很低，當(dāng)濃度達(dá)到300μg/ml時(shí)抑制率仍小于10％。當(dāng)單用FLC時(shí)，雖然抑制率有所升高，但是當(dāng)濃度達(dá)到1024μg/ml時(shí)，真菌生長(zhǎng)抑制率小于20%，與無(wú)處理組相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。然而當(dāng)用濃度為75μg/ml的CSA與FLC聯(lián)合使用時(shí)，F(xiàn)LC的MIC50為32μg/ml，相對(duì)于單用藥降低了32倍之多，與單用FLC相比，差

5、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示當(dāng)FLC和CSA聯(lián)合使用時(shí)其耐藥泵基因和粘附相關(guān)基因ALS3、MDR、CDR1、ERG11、HWP1的表達(dá)量與它們單獨(dú)作用相比明顯降低(P＜0.05)；利用水-烴兩相分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞表面相對(duì)疏水性時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入鈣調(diào)磷酸酶抑制劑后與單用氟康唑相比，其疏水性相對(duì)降低；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其胞內(nèi)鈣離子的濃度變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)氟康唑加入以后，與沒(méi)有加入藥物相比其細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化很小，而

6、加入抑制劑環(huán)孢菌素A以后隨時(shí)間的增加其胞內(nèi)鈣離子逐漸增多，差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：1.白念珠菌在細(xì)胞培養(yǎng)板上能夠形成典型的生物膜，通過(guò)熒光顯微鏡可以看到白念珠菌生物膜隨著時(shí)間的增長(zhǎng)其細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞外多糖基質(zhì)也逐漸增多，48h以后能夠形成典型的生物膜結(jié)構(gòu)。
　　2.生物膜型白念珠菌隨著其不斷地成熟對(duì)氟康唑的耐藥性不斷地增強(qiáng)，而加入鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A能夠增強(qiáng)氟康唑抗生物膜型白念珠菌的敏感性。