C-EBPα對(duì)脂滴相關(guān)蛋白LSDP5轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控.pdf

1、脂滴是細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)藏中性脂質(zhì)的場(chǎng)所,動(dòng)物中被稱為脂肪滴或脂滴,植物中被叫做油體,酵母中被叫做脂肪微體。成熟的脂滴由中性的疏水核和包裹在外的親水磷脂單層膜組成,磷脂膜上募集了多種蛋白質(zhì)被稱為脂滴相關(guān)蛋白,這些蛋白質(zhì)與脂滴的生成、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解有關(guān)。作為脂滴表面的重要物質(zhì),脂滴相關(guān)蛋白有著重要的功能與意義。脂滴相關(guān)蛋白有多種,動(dòng)物中主要是PAT家族蛋白,LSDP5是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的該家族蛋白成員。
　　 根據(jù)預(yù)測(cè),豬LSDP5的啟動(dòng)子序列上含有

2、C/EBPα結(jié)合元件,因此推測(cè)C/EBPα可能會(huì)與豬LSDP5的啟動(dòng)子序列有相互作用調(diào)節(jié)LSDP5的表達(dá)。C/EBPα是CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族中的一員,該家族成員結(jié)合并轉(zhuǎn)錄激活特定基因DNA序列對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)克隆了豬LSDP5基因的啟動(dòng)子序列,并利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和染色質(zhì)免疫共沉淀方法進(jìn)行了啟動(dòng)子活性實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證C/EBPα對(duì)豬LSDP5啟動(dòng)子的影響,得到以下結(jié)果:
　　 1、根

3、據(jù)NCBI上公布的豬LSDP5啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物,獲得一段約1900bp的DNA序列,分析后截取1579bp的序列構(gòu)建pGL3-Basic載體,在NIH/3T3細(xì)胞系里用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)啟動(dòng)子活性,結(jié)果表明所獲得序列具有極顯著的啟動(dòng)子活性；對(duì)豬LSDP5啟動(dòng)子進(jìn)行不同長(zhǎng)度的截短,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在啟動(dòng)子-642bp到-176bp位置片段的啟動(dòng)子活性最高。
　　 2、在NIH/3T3細(xì)胞系里用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)不同轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)

4、子活性的影響,結(jié)果不同轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子共轉(zhuǎn),以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1為對(duì)照,轉(zhuǎn)染C/EBPα后啟動(dòng)子活性有極顯著的上調(diào)。檢測(cè)C/EBPα對(duì)不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子活性的影響,以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1為對(duì)照,結(jié)果pGL3-LSDP5(-642/+60bp)啟動(dòng)子有最強(qiáng)活性。
　　 3、在IBRS2細(xì)胞中,超表達(dá)C/EBPα后,定量PCR檢測(cè)LSDP5基因的mRNA水平變化,結(jié)果表明LSDP5的mRNA水平有顯著的升高。
　　 4、為了尋

5、找C/EBPα結(jié)合到LSDP5啟動(dòng)子調(diào)控LSDP5的表達(dá)的結(jié)合位點(diǎn),對(duì)LSDP5啟動(dòng)子上預(yù)測(cè)到的C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變,在NIH/3T3細(xì)胞系里面經(jīng)C/EBPα轉(zhuǎn)染后,突變型與野生型相比活性顯著下降,推測(cè)C/EBPα可能是經(jīng)過(guò)突變位點(diǎn)序列來(lái)與LSDP5啟動(dòng)子結(jié)合從而調(diào)節(jié)LSDP5啟動(dòng)子活性。
　　 5、在IBRS2細(xì)胞中進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn),細(xì)胞的染色質(zhì)用C/EBPα的特異性抗體進(jìn)行沉淀,解交聯(lián)后回收DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果