c-EBPβ對(duì)淀粉樣前體蛋白基因表達(dá)調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，而AD的一個(gè)明顯病理特征是β樣淀粉多肽(amyloidβ,Aβ)在神經(jīng)組織的沉積。Aβ來(lái)源于淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)的異常裂解。CCAAT-增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(CCAAT enhancer binding proteinsβ,c/EBPβ)是轉(zhuǎn)錄因子c/EBPs家族的重要成員，對(duì)基

2、因的表達(dá)調(diào)控起著重要的作用。本研究旨在探討轉(zhuǎn)錄因子c/EBPβ對(duì)APP基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響及其對(duì)APP基因表達(dá)調(diào)控的作用機(jī)制，進(jìn)一步探討c/EBPβ在AD發(fā)病過(guò)程中的作用，為AD的預(yù)防和治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.載體構(gòu)建：利用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-c/EBPβ慢病毒載體和pCDNA3.1-Sp1真核表達(dá)載體。
　　2.螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(Luci

3、ferase assay)：將c/EBPβ真核表達(dá)載體pCDNA3-c/EBPβ與螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3APP170/147共轉(zhuǎn)染到U87MG細(xì)胞中，用Renilla作為內(nèi)參，通過(guò)對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性的分析，確定c/EBPβ蛋白對(duì)APP基因啟動(dòng)子活性的影響。
　　3.實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real Time PCR,RT-PCR)：用Trizol法提取用c/EBPβ慢病毒和用作對(duì)照的空載體病毒感染的HT22細(xì)胞的總RNA，進(jìn)

4、行反轉(zhuǎn)錄，然后再合成cDNA后進(jìn)行real-time PCR，檢測(cè)c/EBPβ、APP和Sp1基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。
　　4.蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting)：提取用c/EBPβ慢病毒和用作對(duì)照的空載體病毒感染的HT22細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行常規(guī)蛋白免疫印漬實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)c/EBPβ、APP、Sp1及P65蛋白在翻譯水平上的表達(dá)。
　　5.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Co-Immunoprecipitation,Co-IP

5、)：將真核表達(dá)載體c/EBPβ和P300共同轉(zhuǎn)染到HT22細(xì)胞中，48小時(shí)后收獲細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行免疫共沉淀，確定c/EBPβ蛋白和P300蛋白之間是否有直接的相互作用(physical interaction)。
　　結(jié)果：
　　1.載體構(gòu)建結(jié)果：pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-c/EBPβ慢病毒載體和pCDNA3.1-SP1真核表達(dá)載體經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序后，證實(shí)所克隆序列及相位完全正確。
　　2.Luc

6、iferase assay實(shí)驗(yàn)結(jié)果：c/EBPβ蛋白可上調(diào)APP基因啟動(dòng)子（-170到+147）的活性。
　　3.RT-PCR結(jié)果：c/EBPβ過(guò)表達(dá)組的c/EBPβ、APP和Sp1的RNA表達(dá)水平均高于空載對(duì)照組的。
　　4.Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果：c/EBPβ過(guò)表達(dá)組的c/EBPβ、APP、Sp1和P65的蛋白表達(dá)水平均高于空載對(duì)照組的。
　　5.Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果：c/EBPβ蛋白和P300蛋白

7、之間有直接的相互作用。
　　結(jié)論：c/EBPβ對(duì)APP基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平具有上調(diào)作用。其作用機(jī)制可能有：
　　1.c/EBPβ作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控基因的表達(dá)，它對(duì)APP基因表達(dá)調(diào)控的作用機(jī)制可能在于其能促進(jìn)內(nèi)源性Sp1基因的表達(dá)，而Sp1則是APP基因表達(dá)的上調(diào)因子，它可與啟動(dòng)子近端GC盒的結(jié)合，促進(jìn)了APP基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，c/EBPβ和Sp1在基因表達(dá)調(diào)控方面有著協(xié)同作用。
　　2.c/EBPβ過(guò)表達(dá)也能引