嗜熱四膜蟲內(nèi)Ran結(jié)合蛋白1的功能分析.pdf

1、Ran蛋白(RanGTPase)屬于小G蛋白家族，分子量約20～30kD，具有GTP水解酶活性。Ran蛋白與伴侶分子相互作用，可在Ran-GTP/GDP結(jié)合狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變，進(jìn)而執(zhí)行不同的生理功能，可以調(diào)節(jié)染色體穩(wěn)定性、紡錘體組裝、細(xì)胞核組建以及核質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N細(xì)胞進(jìn)程。
　　 Ran結(jié)合蛋白1(Ran-bindingProtein1，RanBP1)是Ran蛋白的必要調(diào)控因子，含有保守Ran結(jié)合區(qū)RBD(Ran-bindingdoma

2、in)，可與Ran蛋白結(jié)合，促進(jìn)Ran-GTP復(fù)合物的水解。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的研究表明RanBP1蛋白在細(xì)胞核質(zhì)運(yùn)輸、中心體的裝配、微管的聚合、紡錘體的組裝甚至細(xì)胞凋亡中都發(fā)揮著重要的作用。
　　 嗜熱四膜蟲（Tetrahymenathermophila）是一種單細(xì)胞的原生動(dòng)物，存在有性生殖與無(wú)性生殖兩種生殖模式，同時(shí)具有二倍體小核和多倍體大核兩種細(xì)胞核，是研究細(xì)胞核動(dòng)態(tài)變化的良好模式體系。嗜熱四膜蟲中Ran蛋白的功能研究表明其對(duì)

3、大核的無(wú)絲分裂有重要的調(diào)控作用，異常的含量表達(dá)甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞發(fā)育停滯。目前尚未有研究探索嗜熱四膜蟲中Ran結(jié)合蛋白1的相關(guān)功能。
　　 本研究首次從嗜熱四膜蟲大核基因組中鑒定出一個(gè)保守的Ran結(jié)合蛋白，并對(duì)其序列特征、定位及其功能進(jìn)行了分析，研究結(jié)果如下:
　　 1.RBP1基因的生物信息學(xué)分析RBP1(TTHERM_00158040)基因開放讀框全長(zhǎng)558bp，擬編碼185個(gè)氨基酸，按照四膜蟲體系規(guī)則將其編碼蛋白命名為

4、Rbp1p。相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定RBP1表達(dá)譜顯示其在四膜蟲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和有性生殖過(guò)程中都有表達(dá)，并在有性生殖過(guò)程中表達(dá)水平提高，與四膜蟲全基因轉(zhuǎn)錄Microarray數(shù)據(jù)(http://tfgd.ihb.ae.en)中RBP1基因的表達(dá)譜相一致。多物蛋白序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)Rbp1p含有一個(gè)保守的Ran結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，并與Ran1蛋白具有相似的分子進(jìn)化。
　　 2.Rbp1p在細(xì)胞內(nèi)的定位將含有HA-tag的載體pNeo-HA-RB

5、P1轉(zhuǎn)入野生型四膜蟲中，使其內(nèi)源性編碼HA-Rbp1p蛋白，以梯度增加巴龍霉素濃度的方法篩選陽(yáng)性細(xì)胞株，使用PCR擴(kuò)增鑒定。免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)生殖期，Rbp1p定位于細(xì)胞胞質(zhì)中，兩個(gè)細(xì)胞核均成“空洞”狀;在結(jié)合生殖初期Rbp1p定位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核無(wú)定位，而后期即“anlagen”期時(shí)，Rbp1p除了定位于細(xì)胞質(zhì)外，還定位于發(fā)生凋亡的舊大核上，直至舊大核完全凋亡。
　　 3.過(guò)表達(dá)Rbp1p導(dǎo)致細(xì)胞核分裂異常將過(guò)表達(dá)載體

6、pXS-RBP1轉(zhuǎn)入野生型四膜蟲，RBP1基因通過(guò)同源重組替代MTT1基因，使得RBP1在Cd2+誘導(dǎo)下受到MTT1基因啟動(dòng)子調(diào)控而過(guò)量表達(dá)Rbp1p。結(jié)果表明Rbp1p過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降，大核的無(wú)絲分裂異常，細(xì)胞分裂末期產(chǎn)生了無(wú)大核的異常細(xì)胞，同時(shí)導(dǎo)致了多小核的產(chǎn)生，并且上述異常依賴于Rbp1p的表達(dá)水平。
　　 4.敲減RBP1表達(dá)抑制大核無(wú)絲分裂將敲除載體pNeo-BP1轉(zhuǎn)入野生型四膜蟲，梯度增加巴龍霉素濃度篩選獲

7、得Neo4基因部分替代RBP1基因的敲減細(xì)胞株。結(jié)果表明敲減RBP1表達(dá)的細(xì)胞株生長(zhǎng)速率下降，大核的無(wú)絲分裂受到抑制，細(xì)胞分裂末期產(chǎn)生了無(wú)大核的異常細(xì)胞。
　　 本研究首次鑒定了四膜蟲RBP1基因，RBP1的過(guò)表達(dá)和敲減均導(dǎo)致細(xì)胞異常發(fā)育，這種異常表型與GTP和GDP鎖定形式的RAN1突變體的表型相一致，暗示Rbp1p可以調(diào)節(jié)正常的Ran-GTP/GDP的濃度梯度，進(jìn)而影響細(xì)胞核的發(fā)育。因此Rbp1p參與了Ran蛋白對(duì)大核無(wú)絲分