AE3基因siRNA表達質粒的構建及對其轉染的心肌細胞H9c2的影響.pdf

1、目的：利用RNA干擾(RNAi)技術，以AE3為靶基因，設計構建siRNA表達質粒，進行測序鑒定，并檢測該表達質粒對大鼠心肌樣細胞系H9c2AE3基因表達的影響，為進一步研究AE3基因在心肌細胞損傷及保護中的作用奠定基礎。 方法： 1.設計具有短發(fā)央結構的三條DNA序列，經退火成互補雙鏈，再克隆至載體pSilencer3.1-H1-hygro中構建重組表達載體，轉化DH5α菌株，提取質粒并進行序列測定。 2.轉染

2、攜帶綠色熒光蛋白的pEGFP-N2質粒，熒光顯微鏡觀察檢測瞬時轉染不同時相的轉染效率，選擇最佳時相用于后續(xù)瞬時轉染靶基因表達抑制率的分析。 3.利用構建成功的siRNA表達質粒，通過脂質體介導轉染H9c2心肌樣細胞，并通過RT-PCR、Western blot檢測細胞中AE3 mRNA和蛋白的表達。 結果： 1.重組質粒轉化DH5 α菌株經氨芐青霉素抗性篩選可見有細菌克隆長出。 2.測序鑒定表明重組質粒中

3、含有針對AE3基因的目的序列。 3.將pEGFP—N2通過脂質體介導，轉染H9c2心肌樣細胞，分別于轉染24h、48h、72h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效果，可見H9c2心肌樣細胞胞漿內有綠色熒光，其中轉染48h的轉染效率82±6％顯著高于轉染24h的轉染效率43±6％(P＜0.01)和轉染72h的轉染效率60±7％(P＜0.05)。因此，按48h最佳轉染時間轉染構建好的siRNA表達質粒。 4.RT-PCR檢測細胞中AE

4、3 mRNA的表達水平，顯示pSilencer-AE3-A可明顯降低H9c2心肌樣細胞中AE3 mRNA的表達。 5.Western blot檢測細胞中AE3蛋白的表達量，顯示pSilencer—AE3-A，pSilencer-AE3-B，pSilencer-AE3-C轉染的H9c2心肌樣細胞AE3蛋白表達分別降低61％，48％，25％。 結論： 1.成功構建AE3基因siRNA表達質粒pSilencer-AE3