RNA干擾對(duì)小鼠腹腔活化巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響.pdf

1、目的：腫瘤壞死因子(TNF)分為腫瘤壞死因子α和腫瘤壞死因子β，TNF-α生物學(xué)作用有殺傷腫瘤、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、抗炎、抗病毒、發(fā)熱反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等，其主要由活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌的，在多種其它細(xì)胞中也有低表達(dá)，如成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。適量的TNF-α可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)部的穩(wěn)定狀態(tài)及抵御各種致病因子具有重要意義，然而，TNF-α的異常分泌可作為機(jī)體炎癥、損傷及休克的重要炎癥介質(zhì)。研究已證明TNF

2、-α不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生多型白細(xì)胞介素和干擾素，這些細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)活性可以相互協(xié)同，形成一系列連鎖放大反應(yīng)，加重炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致機(jī)體的廣泛損傷，造成諸如感染性休克、多器官損害、DIC等危重癥的發(fā)生。TNF-α還具有對(duì)骨組織的吸收作用而造成對(duì)骨的破壞。目前已知與TNF-α有關(guān)的疾病包括：AIDS、貧血、腫瘤、出血性休克、移植排斥反應(yīng)、結(jié)核病、白血病、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。TNF-α參與了眾多疾病的發(fā)生發(fā)展過程，

3、因此在不同水平上阻斷TNF-α，有可能對(duì)與TNF-α有關(guān)的疾病產(chǎn)生治療作用。RNA干擾(RNAi)是利用具有同源性互補(bǔ)序列的雙鏈RNA來誘發(fā)序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，它可以通過抑制蛋白表達(dá)來模擬基因敲除技術(shù)，RNA干擾在植物、真菌及動(dòng)物細(xì)胞中均存在，在抗腫瘤、抗病毒及研究基因功能等方面都有著廣泛的應(yīng)用前景。RNAi可以通過人為的引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA，誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因mRNA降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。所以RNA

4、i可以作為一種簡(jiǎn)單有效的可代替基因敲除技術(shù)來抑制特定基因表達(dá)的有力遺傳工具，RaNAi技術(shù)作為新興的基因阻斷技術(shù)具有明顯優(yōu)勢(shì)，它具有高度特異性，靶基因中一個(gè)堿基的改變就會(huì)使RIgAi效率大幅下降，因此它可以使等位基因特異性沉默；它的高效性可使靶基因表達(dá)的蛋白量下降90％以上，它比反義核酸技術(shù)有效，比基因敲除技術(shù)簡(jiǎn)單，已經(jīng)迅速?gòu)V泛地應(yīng)用到基因功能研究、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和抗病毒感染等熱門領(lǐng)域，并為基因治療開辟了全新的途徑。 本試驗(yàn)利

5、用silentGene-2 U6 Hairpin cloning Systems在體外經(jīng)PCR合成siRNA表達(dá)框架，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄出shRNA引發(fā)干擾。針對(duì)小鼠TNF-α基因選取2個(gè)靶位點(diǎn)，測(cè)定并比較其干擾效果，從而選出敏感的抑制位點(diǎn)，為今后克隆質(zhì)粒提供最強(qiáng)的干擾序列。本文就位點(diǎn)1干擾作用加以論述。 方法: 1、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)：C57BL/6小鼠，雄性(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供)，腹腔注射2ml10g

6、/l淀粉溶液，24小時(shí)后，頸椎脫臼法處死，無菌條件下，剪開腹腔，用4mlHank's液沖洗腹腔，收集沖洗液于離心管中，4℃離心，1000rpm，7min。棄上清，用無菌PBS洗細(xì)胞，4℃離心，1000rpm，7min，棄上清，用完全DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，2×10<'6>個(gè)/ml，接種于6孔板。 2、巨噬細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生能力的監(jiān)測(cè)：細(xì)胞正常生長(zhǎng)后，每孔加10μg/mILPS10μl，分別于刺激2小時(shí)、6小時(shí)、10小時(shí)、14

7、小時(shí)檢測(cè)其TNF-α的分泌量。 3、實(shí)驗(yàn)分組：共分3組。干擾組：給予針對(duì)TNF-α干擾位點(diǎn)的siRNA表達(dá)框架。陰性對(duì)照組：給予正常DMEM培養(yǎng)液。陽性對(duì)照組：給予針對(duì)非同源siRNA表達(dá)框架，這里選擇的是靶向IL-1某一位點(diǎn)的序列。 4、干擾組及陽性對(duì)照組siRNA表達(dá)框架的獲得及檢測(cè)：從GeneBank中查找C57BL/6小鼠TNF-α、IL-1的序列。根據(jù)靶序列篩選原則及Promega公司shRNAtarget D

8、isigner 設(shè)計(jì)軟件，經(jīng)BLAST對(duì)比后，選擇出編碼靶標(biāo)RNA的基因序列，由上海生工公司合成干擾組及陽性對(duì)照組下游引物，利用silentGene-2 u6 Hairpincloning Systems經(jīng)PCR反應(yīng)合成siRNA表達(dá)框架，純化后，用2％瓊脂糖凝膠電泳分析。 5、RNA干擾作用特異性的測(cè)定：IL-1為淋巴細(xì)胞分泌的另一重要的細(xì)胞因子，將其作為陽性對(duì)照，可說明RNAi作用的特異性。 6、TNF-α mRNA

9、的檢測(cè)：收集細(xì)胞，提取RNA，用RT-PCR.方法檢測(cè)TNF-αmRNA，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。 7、細(xì)胞因子的檢測(cè)：干擾組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用ELISA方法檢測(cè)TNF-α、IL-1的分泌情況，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。 結(jié)論: 1、RNA干擾可以有效地抑制原代培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-αmRNA水平及其蛋白的分泌量。 2、RaNA干擾有嚴(yán)格的序列特異性。 3、針對(duì)位點(diǎn)1的干