廣西鴨坦布蘇病毒分離鑒定、全序列分析與間接ELISA方法的建立.pdf

1、鴨坦布蘇病毒病是近年影響我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一，引起該病的病原為鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu Virus，DTMUV)。該病主要引起種鴨和蛋鴨產(chǎn)蛋量大幅下降甚至停產(chǎn)，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。本研究開(kāi)展了近年該病在廣西發(fā)生的臨床病例的診斷及其病原的相關(guān)研究。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　一、DTMUV的分離鑒定、全基因組測(cè)定和遺傳變異分析
　　本研究對(duì)2012-2015年廣西地區(qū)疑似發(fā)生DTMUV感染的臨床

2、病例進(jìn)行RT-PCR快速診斷，并對(duì)陽(yáng)性臨床樣品進(jìn)行病毒分離鑒定，成功分離到四株DTMUV，分別命名為GX120915、GX130330、GX150829、GX151002。對(duì)4個(gè)DTMUV分離株用BHK-21細(xì)胞進(jìn)行噬斑純化，獲得四株含單一病毒的DTMUV。將純化的分離株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定、遺傳變異分析、分子生物學(xué)特性研究、毒力測(cè)定以及動(dòng)物回歸試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GX120915、GX130330、GX150829、GX151002的基因

3、組全長(zhǎng)分別為10991bp、10991bp、10990bp、10992bp，僅含一個(gè)大的閱讀框，編碼3425個(gè)氨基酸的多聚蛋白，兩側(cè)各有一個(gè)非編碼區(qū)。與NCBI公布的51株TMUV核苷酸同源性高于96％，氨基酸的同源性高于98％。GX150829分離株與其他地區(qū)分離株親緣關(guān)系更近，屬同一分支;GX120915、GX130330、GX151002與廣西分離株GX2013G、GX2013H和重慶分離株CQW1的親緣關(guān)系最近，形成了一個(gè)小分支

4、，具有地方特色，這與E基因、NS5基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)構(gòu)相一致。分離株均無(wú)血凝活性。分離株的鴨胚半數(shù)致死量(ELD50)為10-4.32～10-4.68/0.2mL。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，GX120915、GX130330、GX10829、GX151002對(duì)7天齡靖西麻鴨有較強(qiáng)的致病力，發(fā)病率為60％～80％，死亡率為20％～40％，四株分離株人工感染靖西麻鴨的臨床發(fā)病特征與自然感染病例相似。
　　二、DTMUV E蛋白主要抗原

5、區(qū)域的原核表達(dá)與鑒定
　　根據(jù)GX120915株結(jié)構(gòu)蛋白E基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增1194 bp E基因片段克隆至pMD18-T載體中，測(cè)序及酶切鑒定正確后，將目的基因定向克隆至pET-32a表達(dá)載體中，測(cè)序及酶切鑒定正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得目的蛋白，同時(shí)利用鎳離子親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，不同濃度尿素進(jìn)行復(fù)性，SDS-PAGE電泳和Western blot結(jié)果顯示目的蛋白大小

6、約為53 kDa，與預(yù)期一致，表明目的蛋白得到表達(dá)，且具有良好的免疫原性。
　　三、DTMUV E蛋白間接ELISA方法的建立
　　將表達(dá)具有良好免疫原性的E蛋白作為包被抗原，建立檢測(cè)DTMUV抗體的間接ELISA方法，經(jīng)過(guò)優(yōu)化條件后，確定判定陰陽(yáng)性的臨界值為0.354。用建立的ELISA方法檢測(cè)常見(jiàn)鴨源病毒病的陽(yáng)性血清，檢測(cè)結(jié)果均低于臨界值，表明其特異性強(qiáng);批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的平均變異系數(shù)都小于10％，說(shuō)明其穩(wěn)定性好;敏感