鴨甲肝病毒1型間接ELISA和CLEIA抗體檢測(cè)方法的建立.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(Duck hepatitisvirus，DHV)引起的一種高致死率的傳染病，主要感染21日齡以內(nèi)的雛鴨，引起典型的肝炎癥狀，雛鴨死亡率高達(dá)80％以上且傳播迅速，給養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)造成了極大的損失。在鴨肝炎病毒感染的檢測(cè)與診斷方面，主要采用病毒分離、病毒中和試驗(yàn)以及病毒核酸檢測(cè)等方法，雖各有優(yōu)點(diǎn)，但耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法滿足大批量檢測(cè)的需求。因此，本研究選擇我國(guó)DHAV-1

2、流行株的結(jié)構(gòu)蛋白VP1進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，以純化后的VP1蛋白作為檢測(cè)抗原，建立了針對(duì)鴨甲肝病毒1型血清抗體的間接ELISA方法和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)快速檢測(cè)方法。
　　1.鴨甲肝病毒1型VP1基因的克隆與表達(dá)
　　本研究利用RT-PCR技術(shù)，以DHAV-1 RNA為模板，擴(kuò)增出VP1基因，基因片段長(zhǎng)714bp。構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-VP1和pET-32a-VP1，并摸索其表達(dá)條件:將重組表達(dá)質(zhì)粒p

3、ET-28a-VP1和pET-32a-VP1分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta(DE3)中，選用不同的IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析鑒定。結(jié)果表明:VP1基因在pET-28a和pET-32a均獲得表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白大小分別為:27 kDa、47 kDa。本研究選擇表達(dá)量較高的pET-32a-VP1原核表達(dá)質(zhì)粒，利用Ni-NTA親和層析對(duì)VP1重組蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE電

4、泳結(jié)果顯示純度達(dá)到95％以上，可用作檢測(cè)抗原。
　　2.鴨甲肝病毒1型抗體檢測(cè)間接ELISA和CLEIA方法的建立
　　建立的間接ELISA方法和CLEIA方法，特異性均為100％;板內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)分別為:1.16％-4.8％、2.27％-2.55％;板間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)分別為:2.29％-8.6％、2.18％-4.33％;說(shuō)明這兩種方法具有較高的特異性和穩(wěn)定性，且CLEIA方法靈敏度和重復(fù)性優(yōu)于間接ELISA方