甲狀旁腺素聯(lián)合大鼠BMSCs修復兔膝關節(jié)軟骨全層缺損的初步研究.pdf

1、研究背景與目的：由于關節(jié)軟骨內無血管、神經(jīng)和淋巴管分布，而且軟骨細胞為終末分化細胞并受限于軟骨陷窩中，因此軟骨一旦受損常常會引發(fā)不可逆的病理變化并導致關節(jié)功能的減退?，F(xiàn)今還沒有結構、成分、力學性質等與正常關節(jié)透明軟骨相似的再生透明軟骨，所以關節(jié)軟骨受損后的修復仍是醫(yī)學界致力解決的難題?，F(xiàn)有的多種治療措施，如微骨折術、骨髓刺激技術、自體或異體組織(骨膜、軟骨膜、軟骨細胞)移植等均存在種種缺陷，并且不能獲得滿意的臨床療效，從而限制了它們的臨

2、床應用。近年來運用組織工程技術構建的組織工程軟骨替代材料被認為是最有可能解決該難題的處理方法。組織工程包括三大因素：種子細胞、細胞因子與支架材料。骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有多向分化潛能，已經(jīng)被證實可以向脂肪細胞、骨與軟骨細胞等多種組織分化。但是由于體外培養(yǎng)細胞有失分化的趨勢以及其在骨髓中的含量稀少，因此促進BMSCs向軟骨細胞分化，應用異種異體的BMSCs修復軟骨缺損是當今研究的熱點。
　　甲狀旁腺激素（PTH）是親骨性內

3、分泌激素之一，是由甲狀旁腺的主細胞合成與分泌的多肽類激素，具有分解代謝和合成代謝雙重作用的 G蛋白偶聯(lián)受體信號蛋白。其對骨髓間充質干細胞的增殖與分化，骨和軟骨的生長發(fā)育過程中具有重要的調節(jié)作用。PTH1R是PTH和甲狀旁腺激素相關肽(PTHrp)的共同受體，分布于多種組織上，貫穿整個軟骨細胞的增殖與前肥大演變過程。體內研究表明，PTH能夠有效地維持細胞的增殖狀態(tài)，在不同的細胞群體或不同的條件下起著不同的作用，目前的有關機制尚無明確，還需

4、要更多的實驗去證實。所以本實驗重點集中于 PTH能否促進BMSCs向軟骨細胞分化，并初步探討它們之間相互作用的機制。
　　應用組織工程學技術修復軟骨缺損的過程中，細胞支架雖然具有運載與固定種子細胞的作用，但是其性質、孔徑亦會影響種子細胞的性質和功能。目前應用于組織工程來修復軟骨缺損的支架主要有兩類：一類是人工合成的材料，如聚乳酸、聚氨酯類等；一類是生物衍生支架材料，如纖維蛋白凝膠(FG)、脫鈣骨基質等。自國外學者Homminga等

5、初次研究兔關節(jié)軟骨細胞在纖維蛋白凝膠中的生物學行為，證實纖維蛋白凝膠可以使軟骨細胞維持細胞形態(tài)與分化增殖活性并形成細胞外基質。相繼有很多的學者對其進行了更全面深入的研究表明，纖維蛋白凝膠可作為一種有前途的骨軟骨組織工程的應用材料。
　　有鑒于此，本研究欲將PTH誘導后的大鼠BMSCs負載FG凝膠支架上修復新西蘭大白兔膝關節(jié)軟骨缺損。因此本課題的研究內容有：第一，大鼠 BMSCs的分離培養(yǎng)、鑒定以及PTH對體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs增

6、殖、成軟骨細胞分化的影響；第二，在第一部分的基礎上，用PTH/BMSCs/FG異種復合體移植修復兔子關節(jié)軟骨全層缺損模型，并對其修復效果進行檢測分析，為其在軟骨組織工程材料應用提供依據(jù)，為軟骨缺損的修復提供新材料和新途徑。
　　方法：
　　1.抽取SD大鼠股骨骨髓，以全骨髓貼壁培養(yǎng)法對SD大鼠BMSCs進行體外培養(yǎng)并傳代。然后通過觀察其形態(tài)學，運用流式細胞術檢測骨髓間充質干細胞常見的表面標記物 CD44的表達以及用成骨誘導培

7、養(yǎng)基培養(yǎng)并行堿性磷酸酶染色以作鑒定。
　　2.取第四代 BMSCs，運用 PTH在體外對其向成軟骨細胞誘導分化，使用MTT法檢測PTH對BMSCs的增殖分化影響，并通過免疫組化檢測觀察細胞胞漿內 II型膠原蛋白的表達。同時在培養(yǎng)后不同時間點收取樣本使用激光共聚焦顯微鏡術(LSCM)檢測BMSC內的II型膠原蛋白和蛋白多糖的表達情況以及胞內鈣離子的熒光強度。
　　3.選取48只重約2.5kg的新西蘭大白兔制備關節(jié)軟骨缺損模型，

8、雙側膝關節(jié)都納入實驗，并隨機分成4組，每組動物12只。PTH干預組：PTH/BMSCs/FG復合體移植修復組；非PTH干預組：BMSCs/FG復合體移植修復組；缺損組：不作任何移植修復的曠置組；正常組：正常兔關節(jié)組。分別在術后4W，8W，12W各處死16只兔子，獲取雙側的股骨髁標本，對修復組織進行大體、組織學與免疫組化染色觀察并利用國際軟骨修復學會(ICRS)評分標準進行評分驗證各組的修復效果；同時采用實時熒光定量PCR(Real-ti

9、me PCR)和蛋白質印跡法(Western blot)檢測修復組織中II型膠原與蛋白多糖的表達情況。然后將所獲得的數(shù)據(jù)輸入SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，以p<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1. SD大鼠原代BMSCs細胞生長速度較慢，呈紡錘形或多角形，但是傳代后細胞貼壁生長迅速，每5d~7d即可傳下一代，且每一次傳代均獲得純度較高的BMSCs。傳至第4代即可取得純度較好的BMSCs。經(jīng)流式細胞儀檢測，第4代B

10、MSCs的CD44呈高表達，陽性率是95.76％。成骨細胞誘導的第4代BMSCs進行細胞堿性磷酸酶染色，胞漿內可觀察到較多的棕紅色顆粒，堿性磷酸酶呈陽性表達.
　　2.大鼠BMSCs經(jīng)PTH體外培養(yǎng)后，由細胞生長曲線分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PTH處理實驗組的BMSCs的生長增殖能力分別較抑制組與對照組的差別有統(tǒng)計學意義，而抑制組和對照組之間的細胞生長能力沒有顯著的差異。在培養(yǎng)后不同時間點行 II型膠原免疫組化染色與激光共聚焦顯微鏡術檢測，結果

11、表明，實驗組BMSC細胞的II型膠原與蛋白多糖的表達均優(yōu)于對照組，而且隨著培養(yǎng)時間的增加，差別越明顯。在7d、14d時，實驗組鈣離子的熒光峰值分別為7.91±2.34、5.15±1.58，對照組鈣離子的熒光峰值分別為5.37±2.55、2.71±0.89。鈣離子熒光峰值測量顯示實驗組高于對照組，兩時間點p<0.05。
　　3.動物實驗結果證實，在術后第12周，PTH干預PTH/BMSC/FG復合體組關節(jié)軟骨缺損區(qū)被透明樣的組織完全

12、修復，表面平整光滑，修復組織內可見典型的軟骨陷窩形成并含大量的軟骨細胞，排列趨向于柱狀，軟骨下潮線連貫，可見完整的軟骨下骨，與周圍的正常軟骨組織分界消失；修復組織大體和組織學ICRS評分PTH干預PTH/BMSC/FG復合體組顯著優(yōu)于非PTH干預BMSC/FG復合體組和缺損組，與正常關節(jié)組差別不明顯；II型膠原和蛋白聚糖免疫組化染色均為陽性，而且其的平均光密度值，mRNA相對表達量，蛋白平均積分光密度值都要優(yōu)于非PTH干預BMSC/FG

13、復合體組和缺損組，與正常關節(jié)組無顯著差別。
　　結論：
　　1.采用全骨髓細胞貼壁培養(yǎng)法對大鼠BMSC進行分離培養(yǎng)可獲得純度較高的BMSC。
　　2. PTH能夠誘導BMSC向軟骨細胞增殖分化并刺激BMSC分泌Collagen II和Aggrecan，其可能的作用機制是胞內依賴Ca2+信號通路的激活。
　　3.用經(jīng) PTH誘導后的大鼠 BMSC負載于纖維蛋白凝膠(FG)支架建立的PTH/BMSC/FG異種復合體修