自體軟骨細(xì)胞—藻酸鈣復(fù)合物修復(fù)羊膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)全層軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、雖然骨科基礎(chǔ)、臨床研究有了很大的進(jìn)步和發(fā)展，但是關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療仍然是一個(gè)難以解決的問(wèn)題。眾所周知，部分軟骨損傷不能自行修復(fù)，而全層骨軟骨損傷能夠由纖維軟骨修復(fù)，但是這種修復(fù)組織缺乏正常軟骨組織所具有的生物學(xué)、生物化學(xué)、和生物力學(xué)特性，因此在關(guān)節(jié)活動(dòng)過(guò)程中，壓力的刺激下，很容易退變。為此，各種各樣的手術(shù)(如轉(zhuǎn)孔術(shù)、關(guān)節(jié)成形術(shù)、微骨折等)，被應(yīng)用于臨床，試圖刺激骨髓干細(xì)胞，產(chǎn)生具有接近透明軟骨特性的軟骨來(lái)修復(fù)軟骨缺損，但事實(shí)證明，這些修

2、復(fù)組織在壓力刺激下很快發(fā)生退變。本研究試圖以接近人類(lèi)膝關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)的中國(guó)山羊?yàn)閯?dòng)物模型，研究它的軟骨細(xì)胞在體外分離、培養(yǎng)、快速擴(kuò)增的方法；在藻酸鈣培養(yǎng)中的特性；觀察自體軟骨細(xì)胞復(fù)合藻酸鈣修復(fù)山羊膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨缺損的結(jié)果，以及修復(fù)過(guò)程中CPM(continuouspassivemotion，持續(xù)被動(dòng)活動(dòng)儀)對(duì)修復(fù)結(jié)果的影響。 方法：(1)取肩關(guān)節(jié)軟骨組織，體外分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞、對(duì)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行蕃紅“O”、甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原

3、免疫組化染色等表型鑒定。(2)將鑒定證實(shí)為具有正常表型的軟骨細(xì)胞和cyteodex-3放入RCCS(rotarycellculturesystem，旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng))培養(yǎng)，和單層培養(yǎng)做對(duì)比，觀察微載體表面細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，用DNA的變化定量，觀察兩種培養(yǎng)方式細(xì)胞擴(kuò)增的情況，并對(duì)RCCS培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定。(3)將鑒定證實(shí)為具有正常表型的軟骨細(xì)胞和藻酸鈣凝膠復(fù)合，觀察藻酸鈣凝膠內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，用熒光分光光度計(jì)和紫外分光光度計(jì)觀察D

4、NA及GAG的量的變化，同時(shí)對(duì)藻酸鈣凝膠培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定。(4)收集經(jīng)藻酸鈣培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞和基質(zhì)，體外培養(yǎng)組織工程化軟骨并對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)和免疫組化鑒定。(5)于山羊股骨髁負(fù)重面行直徑6mm全層軟骨缺損，分別以空白(缺損內(nèi)未植入任何組織)；骨膜覆蓋；藻酸鈣凝膠填充缺損十骨膜覆蓋；復(fù)合自體軟骨細(xì)胞的藻酸鈣填充缺損+骨膜覆蓋；復(fù)合自體軟骨細(xì)胞的藻酸鈣填充缺損十骨膜覆蓋+CPM治療兩周，五種方式治療，分別于3月，6月取材(復(fù)合自體軟骨

5、細(xì)胞的藻酸鈣填充缺損+骨膜覆蓋+CPM有12月組)，進(jìn)行大體觀察，組織學(xué)檢查和病理評(píng)分。 結(jié)果：(1)由肩關(guān)節(jié)軟骨組織培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞、RCCS擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞、短期培養(yǎng)的復(fù)合軟骨細(xì)胞的藻酸鈣凝膠，經(jīng)蕃紅“O”、甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽(yáng)性，證實(shí)具有正常軟骨細(xì)胞的表型；軟骨細(xì)胞快速貼附于微載體，RCCS能夠快速擴(kuò)增軟骨細(xì)胞，12d內(nèi)能夠擴(kuò)增15～17倍；(2)藻酸鈣為支架培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞能夠保持球形狀態(tài)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，DNA

6、及GAG的含量逐漸增多；體外培養(yǎng)的組織工程化軟骨，經(jīng)蕃紅“O”、甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽(yáng)性。(3)藻酸鈣復(fù)合軟骨細(xì)胞修復(fù)羊負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)面軟骨缺損，從大體觀察、組織學(xué)、生化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，單因素統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)各組均有不同程度的組織修復(fù)，復(fù)合自體軟骨細(xì)胞的藻酸鈣填充缺損+骨膜覆蓋+CPM組效果最好，而且與其它組的區(qū)別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1)體外成功地培養(yǎng)了保持表型穩(wěn)定的羊關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，而且證實(shí)了RCCS

7、比普通單層培養(yǎng)更能夠快速擴(kuò)增軟骨細(xì)胞。 2)藻酸鈣凝膠短期培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，能夠保持軟骨細(xì)胞的表型，分泌GAG和Ⅱ型膠原；軟骨細(xì)胞在藻酸鈣凝膠中培養(yǎng)能夠增殖。 3)利用藻酸鈣介導(dǎo)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞和分泌的基質(zhì)，成功的構(gòu)建了組織工程化軟骨，經(jīng)組織學(xué)和免疫組化鑒定，具有正常軟骨組織的組織學(xué)和生化特性。 4)藻酸鈣復(fù)合自體軟骨細(xì)胞支架填充缺損+骨膜覆蓋+CPM活動(dòng)，能夠較好地修復(fù)山羊膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨缺損，經(jīng)一年觀察，未見(jiàn)退變現(xiàn)