人脂聯(lián)素基因的重疊延伸PCR法克隆及其在畢赤酵母中的誘導表達.pdf

1、本研究利用重疊延伸PCR法克隆出人脂聯(lián)素(ADPN)基因cDNA序列，構建了其克隆載體pGEM-T-ADPN。通過測序對其進行序列分析后，進一步構建其畢赤酵母表達載體pPIC3.5K-ADPN，然后利用電擊法轉化畢赤酵母GSll 5，經甲醇誘導重組酵母表達，并對表達產物進行分析和研究，取得了如下進展： 利用重疊延伸PCR法從人血液中擴增出人脂聯(lián)素基因第二外顯子和第三外顯子編碼序列，并準確拼接，構建了克隆載體pGEM-T-ADPN

2、。通過PCR和酶切初步鑒定正確后，對其進行測序，測序結果和NCBI中登陸號為NM 004797.2的人脂聯(lián)素cDNA序列比對，結果完全一致，同源性為100％。表明人脂聯(lián)素基因已經成功克隆并連接至克隆載體pGEM-T中。 設計分別帶有BamH I和EcoR I兩個酶切位點的人脂聯(lián)素基因引物，以pGEM-T-ADPN為模板，擴增出5'端和3'端分別帶有BamH I和EcoRI兩酶切位點的ADPN基因，然后用這兩種酶切后連接至畢赤酵母

3、表達載體pPIC3.5K中。重組表達載體pPIC3.5K-ADPN轉化大腸桿菌DH5tx并利用其上攜帶的氨芐青霉素抗性基因篩選出抗性菌株，然后做PCR及雙酶切鑒定。經鑒定人脂聯(lián)素基因已經準確地連接到畢赤酵母表達載體pPIC3.5K中。 用電轉化法將重組酵母表達載體pPIC3.5K.ADPN導入甲醇型酵母(Ppastoris)菌株GSll5中，獲得轉化子。將轉化子采用營養(yǎng)缺陷、遺傳霉素、PCR、Soutern雜交篩選后，得到多株重