蓮房原花青素對Aβ25-35致PC12細胞損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、本文從以下幾方面進行論述：
　　第一部分：蓮房原花青素對Aβ25-35所致PC12細胞損傷的保護作用。
　　目的：
　　以Aβ25-35處理PC12細胞構建細胞損傷模型，通過LSPC的干預，觀察其對Aβ25-35致細胞形態(tài)改變、損傷和凋亡情況的保護效果。
　　方法：
　　（1）Aβ25-35染毒時間、劑量和蓮房原花青素干預劑量的確定。
　　將細胞分為對照組和Aβ25-35不同劑量組（5、10、20及4

2、0μM），不同組別細胞分別培養(yǎng)0、6、12、24、48小時，采用CCK-8法在培養(yǎng)結束后分別檢測細胞生長抑制率，確定最佳染毒時間和劑量。隨后，使用不同濃度LSPC（1、2.5、5、10、20及40μg/mL）預孵育細胞，采用CCK-8法檢測細胞活性，探索其保護作用及最佳干預劑量。
　　（2）研究蓮房原花青素對Aβ25-35誘導產(chǎn)生的細胞損傷的保護作用。
　　細胞分為5組：對照組：正常培養(yǎng)；Aβ組：接種24 h后，加入20μM

3、 Aβ25-35繼續(xù)培養(yǎng)24h；LSPC三個細胞活性最佳的劑量組（10、20、40μg/mL）：細胞接種24h后，加入LSPC進行30min，再加入Aβ25-35繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結束后收集細胞和培養(yǎng)液分別檢測細胞LDH釋放量、T-SOD活性及MDA含量。
　?。?）研究蓮房原花青素對Aβ25-35誘導產(chǎn)生的細胞凋亡的保護作用。
　　細胞分為3組：對照組、Aβ組和10μg/mL LSPC組，干預方式同上。細胞形態(tài)學的變化通

4、過倒置顯微鏡觀察；使用Hoechst單染和AnnexinV/PI雙染后，分別使用熒光倒置顯微鏡和流式細胞儀觀察檢測細胞凋亡情況。
　　結果：
　?。?）與對照組細胞相比，不同濃度的Aβ25-35暴露均能夠導致細胞活性的降低，呈現(xiàn)出一定的時間-劑量效應，細胞活性的IC50在12h時約在40μM，24h時約為20μM，因此選擇低劑量長時間暴露的20μM、24h作為染毒劑量和時間。LSPC的干預使細胞有不同程度的升高，在10μg/

5、mL的劑量時，存活率最高（P<0.05）。
　?。?）與對照組相比，Aβ25-35的暴露使細胞內T-SOD酶活性降低，而MDA含量和LDH釋放量升高（P<0.05），提示Aβ25-35的暴露可能降低細胞的抗氧化能力，促進細胞膜的脂質過氧化，引起細胞膜損傷。而不同濃度LSPC的預處理能夠明顯改善這些損傷作用，表現(xiàn)為10μg/mL組降低MDA和LDH釋放量的作用均好于20、40μg/mL組，而40μg/mL LSPC提高T-SOD的作

6、用強于10、20μg/mL組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　（3）鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，LSPC的預處理能夠改善Aβ25-35的暴露造成的細胞數(shù)量降低，細胞形態(tài)變圓及細胞突起退化回縮等情況；Hoechst染色后在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)Aβ組凋亡的細胞數(shù)明顯多于對照組，而LSPC組中細胞凋亡減少；流式檢測凋亡率的結果顯示，對照組細胞總凋亡率一般不超過5％，而Aβ25-35的暴露使細胞總凋亡率顯著升高，達到（33.36±3.05）%，而L

7、SPC組細胞總凋亡率顯著低于Aβ組（P<0.05）。
　　結論：
　　在本實驗研究條件下，Aβ25-35的暴露可以導致PC12細胞受損，使其形態(tài)發(fā)生改變，并促進細胞凋亡的發(fā)生，而LSPC的預孵育能夠改善Aβ25-35誘導的細胞損傷。
　　第二部分：蓮房原花青素對PC12細胞中CREB/BDNF表達的影響及其機制的研究。
　　目的：
　　通過檢測各組細胞中CREB/BDNF的表達情況以及其上游PI3K/AKT

8、和Raf/ERK1/2信號通路的激活情況，探索LSPC對細胞保護作用的具體機制。
　　方法：
　　細胞分為：對照組、Aβ組、LSPC組（干預方式同第一部分）；抑制劑組（LY-特異性AKT通路抑制劑組、PD-特異性ERK通路抑制劑組）：接種后24h換液，加入抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細胞；抑制劑+LSPC組：細胞24h，換液后加入10μg/mL LSPC預處理30min后，加入相應的抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細胞。細胞中B

9、DNF蛋白表達、CREB磷酸化程度以及上游AKT和ERK1/2活化程度使用Western blot法分別檢測，BDNF mRNA的表達量使用Real time PCR法檢測。
　　結果：
　　與對照組比較，Aβ組BDNF蛋白和mRNA的表達量均有降低，其基因的調節(jié)蛋白CREB的活化程度也相應降低，其上游蛋白P-AKT和P-ERK1/2蛋白表達下調，差異有顯著性（P<0.05）；與Aβ組相比，LSPC的預處理顯著增加了BDNF

10、的表達，P-CREB、P-AKT和P-ERK1/2表達升高（P<0.05）；相對于抑制劑組，LSPC組的預處理可以部分改善其對相應蛋白的抑制作用，差異有顯著性（P<0.05），表明LSPC能夠通過這兩條通路調節(jié)CREB/BDNF通路。
　　結論：
　　1、在本實驗研究條件下，Aβ25-35的暴露能夠下調PC12細胞中CREB的活化，降低BDNF表達水平，LSPC的預孵育能改善上述蛋白的表達。
　　2、抑制劑和LSPC的

11、聯(lián)合作用的結果表明，LSPC可能通過上調P-AKT和P-ERK1/2的表達，從而調節(jié)CREB/BDNF的活化，發(fā)揮其保護作用。
　　第三部分：蓮房原花青素對PC12細胞中PERK/eIF2α表達的影響及其機制的研究。
　　目的：
　　通過檢測各組細胞中PERK/eIF2α的激活情況，探索LSPC對細胞內質網(wǎng)應激的改善，并通過CHOP/Caspase-3凋亡通路的檢測和GSK-3β、Tau蛋白磷酸化程度的變化，進一步研究

12、內質網(wǎng)應激對細胞的損傷及LSPC的保護機制。
　　方法：
　　細胞分為：對照組、Aβ組、LSPC組（干預方式同第一部分）；GSK組：細胞接種后，培養(yǎng)24h，換液后加入0.5mM GSK2606414（特異性PERK抑制劑），繼續(xù)培養(yǎng)；Aβ+GSK組：GSK2606414預孵育，30min后加入Aβ，24h后收集細胞。LSPC＋GSK組：提前加入10μg/mL LSPC及GSK2606414預孵育30min，加入Aβ，24h后

13、收集細胞。細胞中PERK/eIF2α的磷酸化程度，以及CHOP/Caspase-3凋亡通路的檢測和GSK-3β、Tau的磷酸化使用Western blot法分別檢測。
　　結果：
　　與對照組比較，Aβ組的PERK和eIF2α的磷酸化程度明顯升高，該通路被活化，差異有顯著性（P<0.05）；與Aβ組相比，LSPC的預處理顯著降低了兩種蛋白磷酸化形式的表達，差異有顯著性（P<0.05）；加入GSK抑制劑后，該通路被抑制，而加入

14、Aβ之后，P-PERK和P-eIF2α的表達相對于抑制劑組有所上升，表明Aβ可能部分激活了PERK/eIF2α通路的活化，引起了細胞內的ERS；而LSPC和PERK抑制劑的聯(lián)用明顯降低了P-PERK和P-eIF2α表達，差異有顯著性（P<0.05）。此外，CHOP/Caspase-3通路以及P-GSK-3β、P-Tau蛋白的表達量與P-PERK、P-eIF2α的變化趨勢一致。
　　結論：
　　1．在本研究實驗條件下，Aβ25