Human Neurotrophin-3綠色熒光表達載體的構(gòu)建及真核表達.pdf

1、目的：Neurotrophin-3(NT-3)是神經(jīng)營養(yǎng)素(Neurotrophins)家族的重要成員。NT-3能促進神經(jīng)細胞的存活、增殖和突觸的生長，對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷能起到保護作用?；蚬こ躺a(chǎn)的NT-3有利于對其生物學(xué)功能進行研究，并且在治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷中將發(fā)揮重要作用。本實驗?zāi)康脑谟谕ㄟ^分子生物學(xué)手段構(gòu)建人神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(Human Neurotrophin-3，hNT-3)綠色熒光真核表達載體，達到在表達NT-3的同時，實時地

2、監(jiān)測到它表達之目的。從而方便于對NT-3功能的研究和對其進行神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病治療效果的分析。 此外，本實驗還對人NT-3基因進行突變，為更深入地研究NT-3的結(jié)構(gòu)、功能及作用機制打下基礎(chǔ)。 在以綠色熒光蛋白載體表達NT-3時，為了更準確地說明NT-3對真核細胞的作用，需要對綠色熒光表達載體pEGFP-N1對真核細胞的生物學(xué)特性是否存在影響有所了解。因此，我們研究了轉(zhuǎn)染增強型綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-N1對C6

3、細胞的增殖性、細胞活力、細胞周期等生物學(xué)特征的影響。 方法：根據(jù)Maisonpierre等人提交的序列設(shè)計引物，并在引物中加上限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I的識別序列。以正常人外周血基因組DNA為模板，保真PCR擴增NT-3片段。EcoR I、BamH 1分別雙酶切PCR產(chǎn)物和綠色熒光表達載體pEGFP-N1，通過T4 DNA Ligase將PCR產(chǎn)物連接入pEGFP-N1，從而構(gòu)建NT-3綠色熒光真核表達載體p

4、EGFP-NT3。測序分析NT-3克隆情況和綠色熒光表達載體pEGFP-NT3構(gòu)建情況。脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒pEGFP-NT3，轉(zhuǎn)染SD大鼠間充質(zhì)細胞和293T細胞。脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染C6細胞，經(jīng)G418篩選，得到穩(wěn)定表達綠色熒光的C6-EGFP細胞。細胞計數(shù)、MTT實驗、流式細胞術(shù)分別測定C6細胞在轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白前后增殖性，細胞活力以及細胞周期等生物學(xué)特性。 易錯PCR(Error Prone PCR，EPP

5、CR)能在目的基因片段內(nèi)隨機引入突變。采用通常在PCR擴增中容易引起突變的保真性較低的Taq酶，在PCR過程中產(chǎn)生hNT-3的突變，并將其克隆到T載體中。 結(jié)果：本實驗克隆的NT-3序列與Maisonpierre等人提交的序列完全一致，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-NT3能夠?qū)崿F(xiàn)NT-3和增強型綠色熒光蛋白融合表達。在轉(zhuǎn)染了pEGFP-NT3的SD大鼠間充質(zhì)細胞和293T細胞中觀察到了綠色熒光。達到了利用綠色熒光蛋白檢測NT-3在