長鏈非編碼RNA HOTAIR促進子宮內(nèi)膜癌進展的機制研究.pdf

1、目的：檢測正常子宮內(nèi)膜組織和內(nèi)膜癌組織中HOTAIR的表達，并分析其與臨床病理特征之間的關系。深入探索HOTAIR對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，侵襲及體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移能力的影響。并探討HOTAIR調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及侵襲機制。
　　方法：利用qRT-PCR技術和原位雜交方法檢測了臨床組織中HOTAIR的表達情況，并對HOTAIR表達與患者臨床病理特征之間的相關性進行了分析。利用數(shù)據(jù)挖掘，對TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。利

2、用AN3CA，KLE，SPEC-2，HEC-1B，RL-95，Ishikawa等細胞株經(jīng)過一系列體內(nèi)體外實驗來檢測HOTAIR對細胞株的增殖、侵襲的影響。利用450K人甲基化芯片檢測HOTAIR對下游基因甲基化的影響。HOXA10被鎖定為HOTAIR其下游靶向基因。并進一步在臨床標本和細胞株實驗中驗證了兩者的關系。
　　結(jié)果：與正常內(nèi)膜組織相比，內(nèi)膜癌組織HOTAIR表達顯著上調(diào)（P<0.001）。且HOTAIR表達水平與臨床分期

3、（P<0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.05）呈正相關。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)高表達HOTAIR的內(nèi)膜癌患者較低HOTAIR表達患者，生存期顯著下降（P<0.05）。體外實驗發(fā)現(xiàn)過表達HOTAIR能夠促進內(nèi)膜癌細胞株的增殖及侵襲能力。相反，沉默HOTAIR則抑制了內(nèi)膜癌細胞株的增殖與侵襲能力。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)過表達HOTAIR促進了內(nèi)膜癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。HOXA10在過表達HOTAIR的細胞株中甲基化明顯。而恢復HOXA10的表達能夠逆轉(zhuǎn)過表達

4、HOTAIR造成的細胞生物學行為的改變。
　　結(jié)論：HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌中顯著高表達；HOTAIR高表達與內(nèi)膜癌預后正相關。HOTAIR能夠促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖和侵襲能力。HOTAIR通過靶向HOXA10調(diào)控子宮內(nèi)膜癌的細胞生物學行為。
　　第一部分 HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及其臨床意義
　　目的：檢測正常子宮內(nèi)膜組織和內(nèi)膜癌組織中HOTAIR的表達，并分析其與臨床病理特征之間的關系。
　　方

5、法：利用qRT-PCR技術檢測了66例內(nèi)膜癌冰凍組織和30例正常內(nèi)膜冰凍組織中HOTAIR的表達；利用原位雜交技術對129例福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織切片（其中包括96例冰凍組織，21例其他內(nèi)膜癌組織和12例不典型增生組織）進行HOTAIR表達檢測及評分。并對HOTAIR表達與患者臨床病理特征之間的相關性進行了分析。利用數(shù)據(jù)挖掘，對TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。
　　結(jié)果：與正常內(nèi)膜組織相比，內(nèi)膜癌組織H

6、OTAIR表達顯著上調(diào)（P<0.001）。且HOTAIR表達水平與臨床分期（P<0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.05）呈正相關。FFPE組織的原位雜交結(jié)果顯示，HOTAIR表達上調(diào)也與肌層浸潤深度（P=0.019）以及淋巴血管間隙浸潤（P=0.015）相聯(lián)系。更重要的是，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)高表達HOTAIR的內(nèi)膜癌患者較低HOTAIR表達患者，生存期顯著下降（P<0.05）。
　　結(jié)論：HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌中顯著高表達； HO

7、TAIR高表達與內(nèi)膜癌預后正相關，提示HOTAIR可能促進子宮內(nèi)膜癌的惡性進展。
　　第二部分 HOTAIR促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及侵襲功能
　　目的：檢測不同子宮內(nèi)膜癌細胞株中HOTAIR的表達，探索HOTAIR對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，侵襲及體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法：Realtime PCR檢測AN3CA，KLE，SPEC-2，HEC-1B，RL-95，Ishikawa五株子宮內(nèi)膜癌細胞株中HOTAIR的表

8、達。通過構(gòu)建過表達質(zhì)粒和發(fā)夾狀RNA（shRNA），對高表達HOTAIR的AN3CA進行下調(diào)HOTAIR，而低表達的Ishikawa上調(diào)HOTAIR的表達。并在體外進行 CCK8，平板克隆，Transwell小室，劃痕實驗等功能實驗研究HOTAIR改變內(nèi)膜癌細胞株增殖及侵襲能力。包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒，構(gòu)建HOTAIR過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株IshikawaHOTAIR細胞株并進行體內(nèi)實驗，包括裸鼠荷瘤實驗，腹腔轉(zhuǎn)移實驗及尾靜脈遠處轉(zhuǎn)移實驗等檢測HOTAI

9、R體內(nèi)改變內(nèi)膜癌細胞株的增殖及侵襲能力。
　　結(jié)果：在未分化轉(zhuǎn)移癌AN3CA細胞中表達最高，而在低分化的Ishikawa細胞中表達最低。體外實驗發(fā)現(xiàn)AN3CA下調(diào)HOTAIR后增殖、遷移和侵襲能力得到明顯抑制；而過表達HOTAIR的Ishikawa細胞的增殖、遷移和侵襲能力則顯著增強。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)過表達HOTAIR的Ishikawa細胞增殖及侵襲能力顯著增強。
　　結(jié)論：HOTAIR能夠促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖和侵襲能力。<

10、br>　　第三部分 HOTAIR通過靶向HOXA10從而影響子宮內(nèi)膜癌細胞的生物學行為
　　目的：探討HOTAIR調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及侵襲機制，探索HOTAIR通過靶向HOXA10甲基化來調(diào)控內(nèi)膜癌進展的可能。
　　方法：構(gòu)建HOTAIR過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株IshikawaHOTAIR和Ishikawacontrol，利用450K人甲基化芯片進行兩組細胞株之間的基因甲基化差異篩查。對差異甲基化改變的基因進行聚類分析，篩選出不同H

11、OTAIR表達情況下甲基化差異表達的基因。我們把目標基因鎖定為甲基化明顯的HOXA10基因。并用westernblot，qRT-PCR等方法對芯片結(jié)果進行驗證。并通過過表達HOXA10進行拯救實驗驗證。最后在正常子宮內(nèi)膜（20例）和子宮內(nèi)膜癌組織（40例）進行免疫組織化學檢測HOXA10和原位雜交檢測HOTAIR，并進行染色評分，驗證兩者表達相關性。
　　結(jié)果：甲基化芯片發(fā)現(xiàn)過表達HOTAIR的穩(wěn)轉(zhuǎn)株較對照組的細胞株，有24566

12、條基因甲基化差異明顯，其中高甲基化改變的達18136條。HOXA10CpG島處高甲基化明顯。高表達HOTAIR的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞中HOXA10的mRNA和蛋白表達均下降。再構(gòu)建HOXA10的高表達質(zhì)粒，通過拯救實驗發(fā)現(xiàn)，HOXA10能夠逆轉(zhuǎn)HOTAIR誘導的細胞生物學行為的改變。與正常內(nèi)膜組織相比，HOXA10在內(nèi)膜癌組織中表達顯著下降，而且其與HOTAIR表達明顯負相關（P=0.0373）。
　　結(jié)論：HOTAIR通過靶向HOXA10