長鏈非編碼RNA HOTAIR促進子宮內(nèi)膜癌進展的機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:檢測正常子宮內(nèi)膜組織和內(nèi)膜癌組織中HOTAIR的表達,并分析其與臨床病理特征之間的關系。深入探索HOTAIR對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖,侵襲及體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移能力的影響。并探討HOTAIR調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及侵襲機制。
  方法:利用qRT-PCR技術和原位雜交方法檢測了臨床組織中HOTAIR的表達情況,并對HOTAIR表達與患者臨床病理特征之間的相關性進行了分析。利用數(shù)據(jù)挖掘,對TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。利

2、用AN3CA,KLE,SPEC-2,HEC-1B,RL-95,Ishikawa等細胞株經(jīng)過一系列體內(nèi)體外實驗來檢測HOTAIR對細胞株的增殖、侵襲的影響。利用450K人甲基化芯片檢測HOTAIR對下游基因甲基化的影響。HOXA10被鎖定為HOTAIR其下游靶向基因。并進一步在臨床標本和細胞株實驗中驗證了兩者的關系。
  結(jié)果:與正常內(nèi)膜組織相比,內(nèi)膜癌組織HOTAIR表達顯著上調(diào)(P<0.001)。且HOTAIR表達水平與臨床分期

3、(P<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)呈正相關。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)高表達HOTAIR的內(nèi)膜癌患者較低HOTAIR表達患者,生存期顯著下降(P<0.05)。體外實驗發(fā)現(xiàn)過表達HOTAIR能夠促進內(nèi)膜癌細胞株的增殖及侵襲能力。相反,沉默HOTAIR則抑制了內(nèi)膜癌細胞株的增殖與侵襲能力。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)過表達HOTAIR促進了內(nèi)膜癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。HOXA10在過表達HOTAIR的細胞株中甲基化明顯。而恢復HOXA10的表達能夠逆轉(zhuǎn)過表達

4、HOTAIR造成的細胞生物學行為的改變。
  結(jié)論:HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌中顯著高表達;HOTAIR高表達與內(nèi)膜癌預后正相關。HOTAIR能夠促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖和侵襲能力。HOTAIR通過靶向HOXA10調(diào)控子宮內(nèi)膜癌的細胞生物學行為。
  第一部分 HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及其臨床意義
  目的:檢測正常子宮內(nèi)膜組織和內(nèi)膜癌組織中HOTAIR的表達,并分析其與臨床病理特征之間的關系。
  方

5、法:利用qRT-PCR技術檢測了66例內(nèi)膜癌冰凍組織和30例正常內(nèi)膜冰凍組織中HOTAIR的表達;利用原位雜交技術對129例福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織切片(其中包括96例冰凍組織,21例其他內(nèi)膜癌組織和12例不典型增生組織)進行HOTAIR表達檢測及評分。并對HOTAIR表達與患者臨床病理特征之間的相關性進行了分析。利用數(shù)據(jù)挖掘,對TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。
  結(jié)果:與正常內(nèi)膜組織相比,內(nèi)膜癌組織H

6、OTAIR表達顯著上調(diào)(P<0.001)。且HOTAIR表達水平與臨床分期(P<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)呈正相關。FFPE組織的原位雜交結(jié)果顯示,HOTAIR表達上調(diào)也與肌層浸潤深度(P=0.019)以及淋巴血管間隙浸潤(P=0.015)相聯(lián)系。更重要的是,生物信息學分析發(fā)現(xiàn)高表達HOTAIR的內(nèi)膜癌患者較低HOTAIR表達患者,生存期顯著下降(P<0.05)。
  結(jié)論:HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌中顯著高表達; HO

7、TAIR高表達與內(nèi)膜癌預后正相關,提示HOTAIR可能促進子宮內(nèi)膜癌的惡性進展。
  第二部分 HOTAIR促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及侵襲功能
  目的:檢測不同子宮內(nèi)膜癌細胞株中HOTAIR的表達,探索HOTAIR對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖,侵襲及體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移能力的影響。
  方法:Realtime PCR檢測AN3CA,KLE,SPEC-2,HEC-1B,RL-95,Ishikawa五株子宮內(nèi)膜癌細胞株中HOTAIR的表

8、達。通過構(gòu)建過表達質(zhì)粒和發(fā)夾狀RNA(shRNA),對高表達HOTAIR的AN3CA進行下調(diào)HOTAIR,而低表達的Ishikawa上調(diào)HOTAIR的表達。并在體外進行 CCK8,平板克隆,Transwell小室,劃痕實驗等功能實驗研究HOTAIR改變內(nèi)膜癌細胞株增殖及侵襲能力。包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒,構(gòu)建HOTAIR過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株IshikawaHOTAIR細胞株并進行體內(nèi)實驗,包括裸鼠荷瘤實驗,腹腔轉(zhuǎn)移實驗及尾靜脈遠處轉(zhuǎn)移實驗等檢測HOTAI

9、R體內(nèi)改變內(nèi)膜癌細胞株的增殖及侵襲能力。
  結(jié)果:在未分化轉(zhuǎn)移癌AN3CA細胞中表達最高,而在低分化的Ishikawa細胞中表達最低。體外實驗發(fā)現(xiàn)AN3CA下調(diào)HOTAIR后增殖、遷移和侵襲能力得到明顯抑制;而過表達HOTAIR的Ishikawa細胞的增殖、遷移和侵襲能力則顯著增強。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)過表達HOTAIR的Ishikawa細胞增殖及侵襲能力顯著增強。
  結(jié)論:HOTAIR能夠促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖和侵襲能力。<

10、br>  第三部分 HOTAIR通過靶向HOXA10從而影響子宮內(nèi)膜癌細胞的生物學行為
  目的:探討HOTAIR調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及侵襲機制,探索HOTAIR通過靶向HOXA10甲基化來調(diào)控內(nèi)膜癌進展的可能。
  方法:構(gòu)建HOTAIR過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株IshikawaHOTAIR和Ishikawacontrol,利用450K人甲基化芯片進行兩組細胞株之間的基因甲基化差異篩查。對差異甲基化改變的基因進行聚類分析,篩選出不同H

11、OTAIR表達情況下甲基化差異表達的基因。我們把目標基因鎖定為甲基化明顯的HOXA10基因。并用westernblot,qRT-PCR等方法對芯片結(jié)果進行驗證。并通過過表達HOXA10進行拯救實驗驗證。最后在正常子宮內(nèi)膜(20例)和子宮內(nèi)膜癌組織(40例)進行免疫組織化學檢測HOXA10和原位雜交檢測HOTAIR,并進行染色評分,驗證兩者表達相關性。
  結(jié)果:甲基化芯片發(fā)現(xiàn)過表達HOTAIR的穩(wěn)轉(zhuǎn)株較對照組的細胞株,有24566

12、條基因甲基化差異明顯,其中高甲基化改變的達18136條。HOXA10CpG島處高甲基化明顯。高表達HOTAIR的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞中HOXA10的mRNA和蛋白表達均下降。再構(gòu)建HOXA10的高表達質(zhì)粒,通過拯救實驗發(fā)現(xiàn),HOXA10能夠逆轉(zhuǎn)HOTAIR誘導的細胞生物學行為的改變。與正常內(nèi)膜組織相比,HOXA10在內(nèi)膜癌組織中表達顯著下降,而且其與HOTAIR表達明顯負相關(P=0.0373)。
  結(jié)論:HOTAIR通過靶向HOXA10

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