lncRNA-AK055783通過ERBB2-PI3K-AKT信號通路調控胃癌細胞增殖和侵襲的機制研究.pdf

1、背景:胃癌是全世界最常見的、發(fā)病率和致死率極高的惡性腫瘤之一。盡管胃癌的診斷和治療手段取得了一些進步，但是由于其高度復發(fā)和轉移的特性，導致胃癌患者預后依然很差，5年生存率低于20％。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機制，開發(fā)有效的胃癌治療新方法具有十分重要的意義。
　　長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200nt、不編碼蛋白質、不直接參與蛋白質合成的RNA分子。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA

2、參與細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生物學過程，并與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。如在卵巢癌、大腸癌、前列腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中，均有多篇lncRNA異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和患者預后相關的報道。然而，胃癌相關lncRNA的作用及其機制研究報道還較少。因此，本研究擬尋找與胃癌相關異常表達的lncRNA，探索其效應及作用機制，將有助于進一步深入理解胃癌的分子基礎。
　　方法:通過GSEA和GCBI數(shù)據(jù)分析，遴選在胃癌中差異性表達的lnc

3、RNA，通過RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）對數(shù)據(jù)結果進行驗證，篩選出符合要求的lncRNA，分析lncRNA的表達水平與胃癌臨床病理特征及預后的關系。將干擾和過表達lncRNA的慢病毒感染胃癌細胞，構建穩(wěn)定沉默和過表達lncRNA的胃癌細胞株。通過MTT、平板克隆形成、Transwell等實驗，觀察lncRNA表達變化對胃癌細胞增殖和侵襲的影響。并建立人胃癌

4、裸鼠移植瘤模型，檢測lncRNA siRNA體內抑瘤效果。最后利用RNA-IP和RNA pull down技術，尋找lncRNA結合并調控的靶蛋白，通過Pathway分析和Western Blot實驗檢測其調控的信號通路。
　　結果:通過生物信息學分析獲得胃癌顯著相關lncRNA-AK055783，該lncRNA與胃癌發(fā)生發(fā)展的關系及其作用機制尚未被報道。通過RT-PCR方法確證，lncRNA-AK055783在MGC803、BG

5、C823、SGC7901、MKN45和AGS5種胃癌細胞中均檢測到表達，在MGC803中表達水平最低，MKN45中表達水平最高。其在胃癌組織中表達水平顯著高于癌旁正常組織(t=10.66，p＜0.001)，并且與胃癌的T分期(x2=5.275，p＜0.05)淋巴結轉移(x2=4.546，p＜0.05)和遠處轉移(x2=4.305，p＜0.05)具有顯著相關性。根據(jù)lncRNA-AK055783在46例胃癌標本中的中位表達水平（lncRN

6、A-AK055783表達變化倍數(shù)4.527）分為高表達組和低表達組，通過生存分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AK055783高表達組患者1、2和3年生存率為73.6％、54.8％和41.5％，而lncRNA-AK055783低表達組患者1、2和3年生存率為94.1％、77.5％和64.7％，Kaplan-Meier生存分析顯示，高表達lncRNA-AK055783組患者生存期顯著短于低表達組(p=0.0109，Mantel-Cox Test)。

7、
　　設計干擾lncRNA-AK055783的shRNA和過表達lncRNA-AK055783質粒并用慢病毒包裝，感染胃癌MGC803和MKN45細胞株，構建穩(wěn)定沉默和過表達lncRNA-AK055783的胃癌細胞株。體外通過MTT、平板克隆形成和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNA-AK055783表達，能顯著抑制胃癌細胞的增殖和侵襲能力。小鼠體內實驗研究發(fā)現(xiàn)，干擾lhcRNA-AK055783表達能抑制胃癌細胞在裸鼠體

8、內生長，并抑制胃癌細胞的淋巴轉移和遠處轉移;而lncRNA-AK055783過表達，則可顯著促進MGC803在裸鼠皮下的生長以及淋巴轉移和遠處轉移。進一步通過免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation，RNA-IP)和RNA pull down技術發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AK055783能夠特異性結合ERBB2蛋白。通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AK055783與ERBB2/PI3K/AKT信號通路顯著相關。熒光素酶

9、報告基因檢測顯示lncRNA-AK055783過表達導致了ERBB2活性增加。Western Blot檢測顯示，lncRNA-AK055783過表達時，ERBB2蛋白水平明顯升高，進而激活了PI3K/AKT信號通路;干擾lncRNA-AK055783后，ERBB2蛋白水平明顯下降，PI3K/AKT信號通路也隨之被抑制。以上結果提示lncRNA-AK055783通過激活ERBB2/PI3K/AKT信號通路促進胃癌細胞增殖和侵襲。