細胞外pH值對超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道的調節(jié)作用研究.pdf

1、背景:目前心腦血管疾病已成為威脅我國人民健康和小康建設的最主要的公共衛(wèi)生問題。我國每年因心血管疾病包括冠心病和腦卒中的死亡人數約為150萬。在心肌梗塞患者發(fā)病時，其局部的缺血缺氧會導致局部較嚴重的酸中毒，由于血液循環(huán)障礙時，不利于代謝產物的排出，而且酸中毒時對局部組織的影響也非常大，特別是對冠脈平滑肌和心肌細胞，因而，在臨床上及時的糾正酸中毒將極大的減少了對心梗心肌細胞的損害。揭示酸中毒對心肌細胞損害的機制，將有助于對某些心臟疾病的預后

2、提供理論基礎。在某些疾病導致機體酸中毒時，會改變心肌的竇性心率，心輸出量減少等癥狀。在正常情況下竇房結是生理起搏點，控制著心臟的跳動，竇房結細胞自動除極頻率決定著心率的快慢。參與竇房結自動除極的離子流目前認為有以下幾種:超極化激活的內向陽離子電流If、持續(xù)性內向離子流IST、內向鈣電流ICa-T、鈉鈣交換電流INa/Ca、延遲整流性鉀電流Ik、背景電流（包括鈉流和鉀流）、D型ICa-L。超極化激活的環(huán)核苷門控離子通道（hyperpola

3、rization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN），目前認為主要有鈉離子和鉀離子流通過，近期有研究發(fā)現還有鈣離子流的成分。HCN通道介導的起搏電流引起竇房結細胞舒張期去極化，從而在心臟自主搏動及心律的調節(jié)等方面起重要的生理作用。體內HCN通道在心臟起博細胞中呈高表達，參與心臟起博的產生及心率調控。有實驗表明，在機體酸中毒時，心率是減慢的，但是對HCN通道的功能變化尚不明確。HC

4、N通道包括四個亞基，其中心臟中包括3個亞基(HCN1，HCN2，HCN4)，這三個亞基在心臟中有可能是同聚體或者是異聚體，為了揭示細胞外不同PH值對HCN通道不同亞基的影響，本實驗利用爪蟾卵母細胞建立表達HCN通道不同亞基的同聚體及異聚體表達模型，來觀察細胞外酸性液對HCN通道不同亞基同聚體或者是異聚體通道電流的影響。
　　目的:建立爪蟾卵母細胞表達的HCN通道同聚體或者異聚體的細胞模型，觀察不同PH酸性液對HCN通道電流的影響。

5、
　　方法:將HCN1、HCN2的cDNA體外轉錄為cRNA后，分別注射至去除濾泡膜的非洲爪蟾卵母細胞中，表達1-3天后使用雙電極電壓鉗技術記錄HCN通道電流，非選擇性阻斷劑CsCl可將其完全阻斷，成功建立了爪蟾卵母細胞表達的HCN通道細胞模型，使用不同PH酸性液觀察對HCN通道同聚體及異聚體電流的影響。
　　結果:在爪蟾卵母細胞表達的HCN1及HCN2通道的同聚體細胞模型上，記錄到了超極化激活的內向陽離子電流，可被非選擇性

6、阻斷劑CsC1所阻斷。在1mmol/L的CsCl作用下，HCN通道產生的電流顯著減小，在-140mV水平，HCN1電流值減少率為83.4％±9.5％(n=5，P＜0.001);HCN2產生的電流減少率為99.7％±0.6％(n=4，P＜0.001)。TRIP8b是HCN1的輔助亞基，可使HCN1的電流幅度顯著增大。與HCN1組相比，HCN1的mRNAs稀釋4倍后等比例與輔助亞基TRIP8b注入細胞后，其電流幅度仍明顯增大，且HCN1+T

7、RIP8b組電流幅度的增大有統計學意義。在不同pH酸性液作用下，HCN1及HCN2同聚體和異聚體通道電流被抑制，且其電流幅度隨pH值的降低而減小。在-140mV水平，從pH6.5至pH5.0，HCN1電流值減少率為24.6％±8.1％(n=6，P＜0.001);HCN2產生的電流減少率為25.6％±6.8％(n=4，P＜0.01);HCN1+HCN2的電流減少率為21.3％±6.5％(n=4，P＜0.001);在不同pH堿性液作用下，H

8、CN1及HCN2同聚體和異聚體通道電流幅度改變并無統計學意義。在-140 mV水平，從pH7.5至pH8.0時， HCN1電流減少率為1.9％±0.1％(n=3，P＞0.05);HCN1+HCN2異聚體電流減少率為5.6％±2.0％(n=3，P＞0.05)。
　　結論:1.HCN1及HCN2的同聚體和異聚體通道能夠在爪蟾卵母細胞中成功表達;2.在不同pH值的酸性液中HCN1及HCN2的同聚體和異聚體通道電流幅度隨pH值的降低而減小