人中性粒細(xì)胞防御素和核苷酸對呼吸道上皮細(xì)胞天然免疫的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、【目的】探討人中性粒細(xì)胞防御素以及細(xì)胞外核苷酸誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞IL-8表達(dá)及其機(jī)制;克隆人中性粒細(xì)胞防御素基因cDNA,研究其cDNA在氣管上皮細(xì)胞的表達(dá),以期為呼吸道感染與炎癥性疾病天然免疫發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識及其防治打下基礎(chǔ).【方法】Biogel P-10分子篩層析分離中性粒細(xì)胞防御素,質(zhì)譜分析、毛細(xì)管電泳鑒定其純度和分子量,瓊脂糖彌散法檢測其抗菌活性.乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)分析試劑對A549細(xì)胞毒作用.LiquiChip分析儀測定10種炎

2、癥反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子的水平.ELISA法測定A549刺激實(shí)驗(yàn)和刺激抑制實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8濃度.RT-PCR方法檢測A549細(xì)胞P2Y受體mRNA表達(dá).反義寡核苷酸技術(shù)進(jìn)行P2Y受體阻斷實(shí)驗(yàn),生物發(fā)光法分析培養(yǎng)上清ATP含量.同位素<'125>I和熒光素FITC標(biāo)記,進(jìn)行中性粒細(xì)胞防御素與A549細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析.增強(qiáng)型綠色熒光蛋白IL-8報(bào)告基因檢測ATP刺激后A549細(xì)胞報(bào)告基因表達(dá).脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pBabe-Neo