高氧誘導(dǎo)SIRT1蛋白的核漿轉(zhuǎn)位在肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:建立高氧損傷肺泡上皮細(xì)胞模型，通過觀察細(xì)胞形態(tài)、凋亡變化，SIRT1蛋白轉(zhuǎn)位情況，SENP1蛋白及乙?；疨53蛋白表達(dá)變化，探討SIRT1蛋白在肺泡上皮細(xì)胞高氧損傷中的意義，以及SIRT1轉(zhuǎn)位抑制劑萊普霉素B對肺泡上皮細(xì)胞高氧損傷的保護(hù)作用。
　　方法:該實(shí)驗(yàn)將體外傳代培養(yǎng)的人肺泡上皮細(xì)胞（HPAEpiC）作為實(shí)驗(yàn)的研究對象。運(yùn)用高體積分?jǐn)?shù)氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞（HPAEpiC）損傷模型為基礎(chǔ)，即給模型組以3L/min的速度通

2、入含900ml/LO2和50ml/LCO2高純混合氣。將傳代培養(yǎng)后的肺泡上皮細(xì)胞(HPAEpiC)隨機(jī)的分為3組，包括對照組、高氧組和高氧+萊普霉素B組。對照組:向?qū)φ战M細(xì)胞內(nèi)加入DMEM高糖培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基是含有10％胎牛血清與1％青鏈霉素，加入培養(yǎng)基后將細(xì)胞培養(yǎng)在溫度為37℃、濕度為5％的CO2培養(yǎng)箱中。高氧組:加入相同培養(yǎng)基后高氧處理細(xì)胞即以3L/min的速度往細(xì)胞內(nèi)通入含有900ml/LO2和50ml/LCO2高度純合的混合氣，

3、處理時間為10min，處理完畢后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。高氧+萊普霉素B組:加入相同的培養(yǎng)基后，加入終濃度為5ng/ml的萊普霉素B，然后以相同的速度通入相同的混合氣，同樣處理時間為10min，處理完畢后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)至12h、24h及48h后，將細(xì)胞收集好后檢測的指標(biāo)是:(1)各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變使用倒置相差顯微鏡觀察并給予拍照;(2)流式細(xì)胞凋亡技術(shù)分別檢測對照組、高氧組和高氧+萊普霉素B組分組培養(yǎng)24h后的細(xì)胞

4、凋亡率;(3)采用免疫熒光檢測分組培養(yǎng)24h后對照組、高氧組和高氧+萊普霉素B組SIRT1蛋白的轉(zhuǎn)位;(4)細(xì)胞培養(yǎng)24h后采用Western Blot檢測以上三組細(xì)胞的SENP1蛋白和乙?；疨531ys(382)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)倒置相差顯微鏡下可以觀察到對照組的細(xì)胞生長情況好，貼壁較好，分布均勻，大多數(shù)的細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)的是長梭形或多角形，細(xì)胞與細(xì)胞間的間距小，培養(yǎng)液中觀察可見懸浮的細(xì)胞少。高氧組的細(xì)胞貼壁較差，生長情

5、況較差，大多數(shù)的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，變成了圓形或橢圓形，培養(yǎng)液中觀察可見懸浮的細(xì)胞較多，細(xì)胞與細(xì)胞間的間距增大。與高氧組相比高氧+萊普霉素B組的細(xì)胞生長情況較好，大多數(shù)的細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)的是長梭形或多角形，貼壁狀況較好，培養(yǎng)液中觀察可見懸浮的細(xì)胞減少，但較對照組稍差。(2)流式細(xì)胞凋亡結(jié)果示:高氧組細(xì)胞凋亡率顯著高于高氧+萊普霉素B組和對照組(P＜0.05);對照組凋亡率最低，三組分別比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(3)免疫熒光結(jié)

6、果顯示:細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，SIRT1蛋白呈現(xiàn)紅色熒光，融合熒光呈紫色。對照組細(xì)胞紅色熒光集中在細(xì)胞核，高氧組紅色熒光在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)均有分布，且較對照組，細(xì)胞質(zhì)的紅色熒光明顯，轉(zhuǎn)位細(xì)胞較對照組增多，差異有顯著性（P＜0.05），但高氧+萊普霉素B組轉(zhuǎn)位細(xì)胞率高于對照組，但低于高氧組，差異具有顯著性(P＜0.05)。(4)與對照組相比，高氧組細(xì)胞處理24h后HPAEpiC細(xì)胞內(nèi)SENP1蛋白的表達(dá)相對于對照組來說偏高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、(P＜0.05)。處理24h后高氧組細(xì)胞內(nèi)乙?；疨53蛋白的表達(dá)高于對照組及高氧+萊普霉素B組的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。高氧+萊普霉素B組乙?；疨53蛋白的表達(dá)高于對照組，但低于高氧組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:SIRT1作為抗氧化應(yīng)激的重要蛋白參與了高氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡及肺損傷。SIRT1介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制是肺泡上皮細(xì)胞暴露于高氧后，促使SENP1蛋白表達(dá)增多，從而使SIRT