FOXO1在TNF-α誘導急性肺損傷中肺泡上皮細胞凋亡中的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　急性肺損傷（acute lung injury，ALI)是由各種致病因素導致呼吸膜損傷，致彌漫性肺間質及肺泡水腫、透明膜形成，引起進行性呼吸窘迫和難以糾正的低氧血癥。ALI繼續(xù)發(fā)展可形成急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS)。
　　ALI發(fā)病機制尚未完全闡明，過度放大的炎癥反應及氧化應激引起肺泡上皮過度凋亡所致的呼吸膜損傷是其重要發(fā)病機制之一。T

2、NF-α是ARDS中介導炎癥反應放大的主要炎癥介質，其濃度與病情嚴重程度、臨床預后密切相關。TNF-α在氧化應激的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用，它能誘導內皮細胞、中性粒細胞等產生大量活性氧（Reactive Oxidative Species，ROS）。此外，過度炎癥反應也可導致結構細胞內源性ROS生成增多，加之ROS清除酶合成不足時，體內氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，ROS水平明顯升高，導致氧化應激的發(fā)生。針對ARDS的治療，應著重抑制過度炎癥

3、反應和氧化應激，有效抗炎與早期免疫調控同等重要，以避免肺組織結構細胞損傷的加重。
　　在ARDS患者及小鼠模型中均發(fā)現有廣泛的肺泡上皮細胞凋亡，是其重要發(fā)病學基礎。目前對ARDS肺泡上皮細胞凋亡的機制尚未完全了解。研究發(fā)現叉頭框（forkhead box, FOX）蛋白家族O1亞型（FOXO1）在TNF-α誘導的細胞凋亡相關基因表達調控及細胞凋亡中起重要作用。
　　FOX（Forkhead box）蛋白家族是一類DNA結合區(qū)

4、具有翼狀螺旋結構的轉錄因子，可直接參與基因轉錄的調節(jié)及協(xié)同其他轉錄因子進行轉錄調節(jié)，于1989年首次在果蠅被發(fā)現。FOXO是FOX家族的一個亞群，在哺乳動物包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6四個亞型，四個亞家族成員在體內各組織均有表達，但表達水平各有差異，可能與特定的細胞功能有關，FOXO1在脂肪和骨骼肌、肺組織高表達。FOXOs可直接參與基因轉錄的調節(jié)及協(xié)同其他轉錄因子進行轉錄調節(jié)，在哺乳動物細胞的凋亡、氧化應激、細

5、胞周期阻滯、DNA損傷/修復、腫瘤發(fā)生及糖代謝調節(jié)中起著重要作用。FOXOs蛋白的活性可受磷酸化、乙?；⒎核鼗?、甲基化調節(jié)，其中磷酸化是最主要的調節(jié)方式。FOXOs磷酸化失去活性，并與14-3-3蛋白結合，二者復合物從胞核轉移至胞漿，在胞漿發(fā)生泛素化而降解。
　　研究發(fā)現FOXOs高表達時，細胞的生長受到抑制，而當FOXOs從細胞漿轉位至細胞核時，將促進細胞的凋亡。FOXOs并非總是引起細胞損傷，有研究表明FOXO1、FOXO3

6、a、FOXO4缺失，氧自由基生成增加，氧化應激水平升高，細胞損傷增加[18]。表明，FOXOs對細胞凋亡或存活的影響并非一成不變，可能受多種因素影響，如細胞類型、刺激因素、細胞所處環(huán)境等。我們推測FOXO1在急性肺損傷TNF-α誘導肺泡上皮細胞凋亡中有重要作用，深入研究在該病理過程中的表達及其生物學意義，對制定ALI救治策略具有重要意義。
　　綜上所述，本課題的研究目的如下：
　　1.探討TNF-α中和上調Foxo1表達，抑

7、制LPS致小鼠急性肺損傷中的作用及機制。
　　2.構建FOXO1真核過表達質粒并對其活性進行鑒定。
　　3.初步研究FOXO1對TNF-α誘導A549細胞凋亡的影響及機制
　　研究方法：
　　1.TNF-α中和上調Foxo1表達，抑制LPS致小鼠急性肺損傷的作用及機制所有小鼠隨機分為對照組(Controlgroup)、LPS組（LPS group）、TNF-a中和組（TNFR-Fc group）。LPS組、TNF

8、-a中和組氣管霧化LPS溶液5mg/kg，TNF-a中和組于LPS霧化前24小時腹腔注射依那西普0.4mg/kg。LPS組、TNF-a中和組于LPS溶液霧化后2小時處死小鼠，收集肺組織。測量三組小鼠肺濕/干重比；取三組小鼠肺組織常規(guī)固定、脫水、包埋、切片，觀察小鼠肺組織病理并行肺損傷半定量評分；TUNEL法檢測肺組織細胞凋亡；RT-PCR檢測肺組織Foxo1、NF-κB/p65、Bcl-2/Bax mRNA轉錄水平；Western Bl

9、ot檢測肺組織Foxo1、NF-κB/p65磷酸化水平及Bcl-2/Bax蛋白比值；檢測小鼠肺組織丙二醛含量及總抗氧化能力。
　　2.FoxO1綠色熒光蛋白質粒載體的構建及鑒定A549細胞，提取總RNA，按逆轉錄試劑盒制備cDNA。根據 GenBank提供的人FOXO1基因的序列設計引物，PCR擴增FOXO1全長序列，1％瓊脂糖凝膠電泳，切取含1987bp的目的片段凝膠，膠回收試劑盒回收純化目的片段。
　　用XhoI和Kpn

10、I分別酶切GV230空質粒和上述回收、純化的FOXO1目的片段，37℃酶切過夜,將酶切產物及FOXO1片段經1%凝膠電泳后再次切膠回收，獲得帶有黏末端的線性GV230載體和FOXO1全長CDS，利用T4連接酶將二者16℃連接過夜。將連接產物轉化至感受態(tài)細胞DH5α，含卡那霉素的LB平板篩選后，挑取單克隆菌落，37℃搖菌過夜，提取質粒，并通過PCR、酶切及測序鑒定重組質粒，將質粒轉染入細胞，熒光顯微鏡及Western blot檢測FOXO

11、1的表達。
　　3.FOXO1對TNF-α誘導A549細胞凋亡的影響及機制
　　3.1 TNF-α刺激細胞FOXO1 mRNA及蛋白磷酸化水平將A549細胞分為對照組、TNF-α組，TNF-α組采用不含血清10ng/mL TNF-α培養(yǎng)基刺激細胞,24小時后收集細胞；RT-PCR及WB檢測FOXO1表達。
　　3.2 FOXO1高表達對TNF-α誘導A549細胞凋亡的影響及機制
　　3.2.1 實驗分組細胞分為對

12、照組、TNF-a組、FOXO1質粒組、陰性對照組，FOXO1質粒組、陰性對照組分別轉染相應質粒，轉染10小時后，這兩組和TNF-α組均采用不含血清10ng/mL TNF-α培養(yǎng)基刺激24小時，收集細胞或進行其他實驗；
　　3.2.2 RT-PCR檢測FOXO1、NF-ΚB/p65、Bcl-2、Bax、Mn-SOD、CAT mRNA轉錄水平
　　3.2.3 Western Blot檢測FOXO1、NF-ΚB蛋白磷酸化水平及Bc

13、l-2/Bax比值
　　3.2.4 Annexin V-FITC法檢測細胞凋亡率轉染FOXO1綠色熒光蛋白質粒，增強FOXO1表達，予10ng/mL TNF-α刺激細胞24小時，Annexin V-FITC法檢測細胞凋亡率。
　　3.2.5 細胞活性氧水平檢測轉染FOXO1綠色熒光蛋白質粒，增強FOXO1表達，予10ng/mL TNF-α刺激細胞24小時，采用活性氧檢測試劑盒檢測細胞內活性氧的水平。
　　4.統(tǒng)計學處理

14、
　　應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差（X?S）表示。所有數據均進行方差齊性檢驗，組間均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。方差齊時多重比較采用LSD檢驗法，方差不齊時多重比較采用Dunnett′s T3檢驗法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.探討TNF-α中和上調Foxo1表達，抑制LPS致小鼠急性肺損傷中的作用及機制（重排序號）
　　1.1

15、 小鼠肺組織濕/干重比LPS組與TNF-α中和組小鼠肺組織濕/干重比高于對照組，LPS組高于TNF-α中和組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　1.2 各組小鼠肺組織病理改變及半定量評分
　　1.2.1 病理改變小鼠肺組織病理切片行HE染色，對照組肺泡結構完整，肺泡壁薄，間質未見炎癥細胞浸潤，無出血、滲出；LPS組小鼠肺泡壁破壞嚴重，間質可見大量炎癥細胞浸潤，血管床破壞伴出血；TNF-α中和組損傷程度較LPS組輕。<

16、br>　　1.2.2 小鼠肺損傷半定量評分LPS組與TNF-α中和組肺損傷半定量評分高于對照組，LPS組高于TNF-α中和組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　1.3 小鼠肺組織細胞凋亡LPS組、TNF-α中和組對照組肺組織細胞凋亡高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；LPS組高于TNF-α中和組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　1.4 小鼠肺組織Foxo1、NF-kB、Bcl-2/Bax mRNA轉

17、錄水平
　　1.4.1 肺組織Foxo1 mRNA轉錄水平LPS組與TNF-a中和組Foxo1 mRNA水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TNF-a中和組高于LPS組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　1.4.2 肺組織NF-ΚB p65、Bcl-2/BaxmRNA轉錄水平LPS組與TNF-α中和組NF-κB P65mRNA轉錄水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；LPS組高于TNF-a中和

18、組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。LPS組與TNF-a中和組Bcl-2/Bax mRNA轉錄水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）； LPS組低于TNF-a中和組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　1.5 小鼠肺組織Foxo1、NF-κB蛋白磷酸化水平及Bcl-2/Bax蛋白比值
　　1.5.1 肺組織Foxo1蛋白磷酸化水平LPS組小與TNF-α中組鼠肺組織p-Foxo1/Foxo1高于對照組，差異有統(tǒng)

19、計學意義（P＜0.05）；LPS組高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　1.5.2 肺組織NF-κB/p65蛋白磷酸化水平及Bcl-2/Bax比值LPS組與TNF-α中和組p-NF-κB/NF-κB蛋白高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；LPS組高于TNF-α中和組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）LPS組與TNF-a中和組Bcl-2/Bax低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；LPS組低于TN

20、F-α中和組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　1.6 小鼠肺組織MDA含量LPS組、TNF-α中和組MDA高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；LPS組高于TNF-α中和組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　1.7 小鼠肺組織總抗氧化能力LPS組、TNF-α中和組總抗氧化能力低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；LPS組低于TNF-α中和組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2.構

21、建及鑒定FOXO1真核過表達質粒載體并對其活性進行鑒定
　　2.1 FOXO1 CDS全長序列PCR擴增及鑒定經上海英濰捷基公司測序證實， PCR產物膠回收產物與Pubmed上提供的人Foxo1 CDS基因序列一致。
　　2.2 質粒酶切電泳未經酶切的GV230空質粒和GV230-FOXO1重組質粒因可能存在超螺旋，開環(huán)，線性等不同的構象而具有不同的遷移速率，在瓊脂糖凝膠電泳中呈現大小不同的條帶。經XhoⅠ、Kbp I雙酶切

22、后的GV230空質粒呈線性，電泳呈一條條帶。GV230-FOXO1重組質粒膠經XhoⅠ、Kbp I雙酶切后電泳呈兩條帶。
　　2.3 質粒測序結果取酶切驗證正確的GV230-FOXO1重組質粒送英濰捷基公司測序，與NCBI比對正確。
　　2.4 質粒轉染熒光驗證質粒轉染10小時后，對照組無熒光， FOXO1重組質粒組及陰性對照組見明顯綠色熒光，表明質粒已成功轉入細胞并表達蛋白。
　　2.5 Western blot檢測

23、FOXO1蛋白表達對照組及轉染空質粒GV230組FOXO1蛋白表達量無明顯差異（P>0.05）；而FOXO1質粒組FOXO1蛋白表達量明顯高于對照組及陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3. FOXO1對TNF-α誘導A549細胞凋亡的影響及機制
　　3.1 TNF-α刺激A549細胞FOXO1 mRNA轉錄水平對照組FOXO1 mRNA轉錄水平高于TNF-α組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　

24、3.2 TNF-α刺激A549細胞FOXO1蛋白磷酸化水平TNF-α組p-FOXO1/FOXO1高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3.3 FOXO1對TNF-α誘導A549細胞凋亡影響TNF-α組、FOXO1質粒組、陰性對照組細胞凋亡率高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；TNF-a組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；FOXO1質粒組低于TNF-α組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0

25、5)。
　　3.4 FOXO1對NF-ΚB、Bcl-2/Bax mRNA轉錄水平影響TNF-α組、FOXO1質粒組、陰性對照組NF-κB mRNA轉錄水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；TNF-α組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；FOXO1質粒組低于TNF-α組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　TNF-α組、FOXO1質粒組、陰性對照組Bcl-2/Bax mRNA比值低于對照

26、組,差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；TNF-α組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；FOXO1質粒組明顯高于TNF-α組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3.5 FOXO1對NF-κB蛋白磷酸化水平影響TNF-α組、FOXO1質粒組、陰性對照組p-NF-κB/NF-κB比值高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；TNF-a組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；FOXO1質粒組明顯

27、低于TNF-α組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3.6 FOXO1對Bcl-2/Bax蛋白水平影響TNF-α組、FOXO1質粒組、陰性對照組Bcl-2/Bax蛋白比值低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；TNF-a組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；FOXO1質粒組高于TNF-α組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3.7 FOXO1對TNF-α誘導A549活性氧

28、水平影響3.8 FOXO1對CAT、SOD mRNA轉錄水平影響TNF-α組、FOXO1質粒組、陰性對照組CAT比值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；TNF-α組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；FOXO1質粒組明顯高于TNF-α組和陰性對照組(P<0.05)。
　　TNF-α組、FOXO1質粒組、陰性對照組SOD比值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；TNF-α組與陰性對照組間差異無統(tǒng)