基底外側(cè)杏仁核多巴胺受體及P-ERK蛋白與丙泊酚復(fù)吸的關(guān)系.pdf

1、目的:
　　建立丙泊酚依賴大鼠戒斷2周模型，在環(huán)境線索誘導(dǎo)的丙泊酚復(fù)吸實(shí)驗(yàn)前使用藥物干預(yù)，探索基底外側(cè)杏仁核多巴胺受體在丙泊酚復(fù)吸中的作用，并進(jìn)一步探究基底外側(cè)杏仁核P-ERK蛋白與丙泊酚復(fù)吸的關(guān)系，從而完善丙泊酚成癮神經(jīng)生理學(xué)機(jī)制，為臨床脫毒治療及職業(yè)預(yù)防提供新策略。
　　方法:
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，體重250-300g，年齡14周。由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。使用5％水合氯醛麻醉后，行右側(cè)頸外靜脈置管及雙側(cè)

2、基底外側(cè)杏仁核(Basolateral mygdala，BLA)置管。術(shù)后前3天經(jīng)頸外靜脈注射0.3ml青霉素14.4萬(wàn)單位抗感染?；謴?fù)7天后大鼠進(jìn)入連續(xù)14天的丙泊酚(1.7mg/kg.poke)自身給藥行為實(shí)驗(yàn)期。每次行為實(shí)驗(yàn)結(jié)束后老鼠放回飼養(yǎng)籠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)。
　　1.建立丙泊酚復(fù)吸模型:將每只實(shí)驗(yàn)大鼠放入訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)籠內(nèi)進(jìn)行為期14天的丙泊酚自身給藥行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)籠壁設(shè)有兩個(gè)鼻觸孔，其內(nèi)分別配置了有效開(kāi)關(guān)和無(wú)效開(kāi)關(guān)。進(jìn)入訓(xùn)練期

3、時(shí)籠燈和有效鼻觸孔內(nèi)黃燈亮。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)按固定比率(FR=1)進(jìn)行，即大鼠鼻觸一次有效鼻觸孔泵注系統(tǒng)將注射一次丙泊酚（1.7mg/kg，Self-administration;SA組）或脂肪乳劑(0.17ml/kg，Control;CT組)，并伴隨有籠燈和鼻觸黃燈的熄滅和藥物泵注聲音（辨別刺激線索，提示有效鼻觸可獲得藥物注射）。鼻觸無(wú)效鼻觸孔泵注系統(tǒng)不給予注射丙泊酚或脂肪乳劑。泵注系統(tǒng)設(shè)有30秒的不應(yīng)期，即在此期間計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)僅記錄大鼠

4、鼻觸反應(yīng)，而有效鼻觸將不能獲得藥物注射。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間計(jì)算機(jī)將自動(dòng)記錄大鼠的有效鼻觸、無(wú)效鼻觸和總藥物注射次數(shù)。待14天的行為訓(xùn)練結(jié)束，并確認(rèn)大鼠已建立有穩(wěn)定的自身給藥行為后放回飼養(yǎng)籠，給予每日約20g飼料，不限飲水[1]。在停藥戒斷的14天期間大鼠脫離給藥環(huán)境及相關(guān)刺激并單籠飼養(yǎng)。在停藥的第15天將大鼠放入訓(xùn)練籠行復(fù)吸實(shí)驗(yàn)，從而建立大鼠丙泊酚復(fù)吸模型。復(fù)吸實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段共計(jì)2小時(shí)，即前1小時(shí)在籠燈及鼻觸燈關(guān)閉的情況下測(cè)定訓(xùn)練籠空間環(huán)境

5、誘導(dǎo)的復(fù)吸情況;后1小時(shí)燈光和程序設(shè)置與前期丙泊酚自身給藥訓(xùn)練相同，鼻觸一次有效開(kāi)關(guān)后將獲得條件性刺激（籠燈、鼻觸黃燈及泵注聲音），但并不給予丙泊酚藥物獎(jiǎng)賞[2]。全程使用計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄大鼠有效和無(wú)效鼻觸次數(shù)。
　　2.藥物干預(yù)丙泊酚復(fù)吸實(shí)驗(yàn):
　　1)取24只丙泊酚戒斷14天的大鼠并隨機(jī)分為丙泊酚復(fù)吸組(relapse，RL組)，SC組、D1R0.5組和D1R2.5組(n=6)，在復(fù)吸實(shí)驗(yàn)30分鐘前在SC組，D1R0.5組

6、和D1R2.5組大鼠的雙側(cè)BLA內(nèi)分別行微量注射D1受體拮抗劑SCH-23390(0、0.5和2.5ug/side)[3]，觀察其對(duì)各組大鼠復(fù)吸行為學(xué)的影響，并使用Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)各組大鼠基底外側(cè)杏仁核(BLA)中P-ERK和T-ERK的水平變化。
　　2)取24只丙泊酚戒斷14天的大鼠并隨機(jī)分為RL組，SC組、D2R0.5組和D2R2.5組(n=6)，在復(fù)吸實(shí)驗(yàn)前30分鐘前在SC組，D2R0.5組和D2R2.5

7、組大鼠的雙側(cè)BLA內(nèi)分別行微量注射D2受體抑制劑Eticlopride（0，0.5和2.5ug/side）[4]，觀察其對(duì)大鼠復(fù)吸行為學(xué)的影響。
　　3.自發(fā)活動(dòng)度實(shí)驗(yàn)
　　另取18只BLA處置管的空白大鼠并隨機(jī)分為L(zhǎng)M0組，LM0.5組和LM2.5組(n=6)，分別在雙側(cè)BLA處微量注射D1受體拮抗劑SCH-23390(0，0.5和2.5ug/side)，30分鐘后將單只大鼠放入自發(fā)活動(dòng)度檢測(cè)箱，使用攝像跟蹤系統(tǒng)自動(dòng)記錄大

8、鼠2小時(shí)自發(fā)活動(dòng)情況（水平運(yùn)動(dòng)距離）。
　　4.BLA中P-ERK蛋白與丙泊酚復(fù)吸的關(guān)系:將脂肪乳對(duì)照組(control; CT組)、丙泊酚自身給藥組（self-administration; SA組）、丙泊酚戒斷組（withdraw; WD組）、丙泊酚復(fù)吸組（relapse，RL組）(n=6)四組大鼠在相應(yīng)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束期后即刻行5％水合氯醛深麻醉后并斷頭取腦組織，使用Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)各組大鼠BLA磷酸化-

9、ERK(Phosphorylated-ERK，P-ERK)、總-ERK(Total-ERK，T-ERK)的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.在丙泊酚靜脈自身給藥實(shí)驗(yàn)中，與CT組相比，SA組第2天的有效鼻觸開(kāi)始明顯增加(P＜0.01)，而CT組和SA組間的無(wú)效觸鼻次數(shù)未出現(xiàn)明顯差異(P＞0.05);并隨訓(xùn)練天數(shù)逐漸增加，在實(shí)驗(yàn)第10天SA組的有效鼻觸次數(shù)趨于穩(wěn)定(P＞0.05);與SA組相比，RL組有效觸鼻次數(shù)明顯增加(P＜0.05

10、)，而且條件性線索誘發(fā)的有效觸鼻次數(shù)較實(shí)驗(yàn)籠空間環(huán)境的誘導(dǎo)作用更強(qiáng)(P＜0.01);
　　2.雙側(cè)BLA處微量注射D1受體拮抗劑SCH-23390藥物干預(yù)復(fù)吸實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與RL組和SC組相比，D1R0.5組和D1R2.5組的有效鼻觸次數(shù)明顯減少(P＜0.01);在Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組P-ERK和T-ERK表達(dá)組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　3.雙側(cè)BLA處微量注射D2受體拮抗劑Eticloprid

11、e藥物干預(yù)復(fù)吸實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與RL組和SC組相比，D2R0.5組和D2R2.5組的有效鼻觸次數(shù)并無(wú)明顯下降(P＞0.05);
　　4.在自發(fā)活動(dòng)度實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與SC組相比，D1R0.5組和D1R2.5組大鼠在2小時(shí)內(nèi)的水平運(yùn)動(dòng)距離沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　5.在Western blot實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與CT組相比，WD組和RL組BLA內(nèi)的P-ERK表達(dá)水平明顯增加(P＜0.01)。與SA組相比WD組和RL組表達(dá)同樣