沉默URG11基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞功能的影響.pdf

1、1.1目的:
　　URG11在肝癌、胃癌、肺癌、甲狀腺癌、膀胱癌等腫瘤組織證實(shí)比正常組織表達(dá)高[1-5]，同時(shí)也在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞黏附、遷移、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移、以及信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)都有關(guān)鍵作用[6-9]。有研究通過(guò)siRNA技術(shù)干擾胃癌細(xì)胞URG11的表達(dá)，胃癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力受到明顯抑制，而且還可顯著削弱其在體外轉(zhuǎn)移和侵襲能力，以及抑制在動(dòng)物體內(nèi)的成瘤性和生物學(xué)行為[10-14],腫瘤的生物學(xué)行為明顯受到抑制。經(jīng)過(guò)我們前期研究

2、，證實(shí)了URG11在前列腺癌中比正常前列腺組織表達(dá)有差異，并且URG11表達(dá)強(qiáng)度與其在癌癥的病理等級(jí)、分化程度、TNM及是否轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。在前列腺癌細(xì)胞細(xì)胞系中URG11 mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于前列腺上皮細(xì)胞，且有顯著性差異，在LNCaP系中表達(dá)異常最顯著[15]。然而URG11在前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚未闡述，RNA干擾（RNAi)是一種新興的的基因診治方法，是指利用小RNA序列抑制特定基因信號(hào)序列，利用治療序列的siRN

3、A使細(xì)胞出現(xiàn)特定基因缺失，以達(dá)到某些實(shí)驗(yàn)或治療目的，在腫瘤的基因診治中有光明前途[10-14]。本課題擬擬運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染（慢病毒質(zhì)粒）、Real-time-PCR和Western blot檢測(cè)沉默URG11在前列腺癌細(xì)胞（LNCaP細(xì)胞系）表達(dá)特性及MTS/CCK-8法、流式檢測(cè)技術(shù)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（劃痕檢測(cè)）及 Transwell檢測(cè)發(fā)探究沉默URG11基因后對(duì)于LNCaP細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲力的生物學(xué)行為的改變影響，本研究采用RNAi方

4、法干擾沉默URG11在前列腺癌細(xì)胞的中表達(dá)，明確其在PCa中發(fā)生、發(fā)展作用功能，闡明URG11在PCa中發(fā)病變機(jī)制，證實(shí)URG11基因可以作為PCa的基因治療提供了一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)URG11在PCa表達(dá)特性及基因靶向診治有效性，為治療PCa基因治療提供新的路線和理論基礎(chǔ)。
　　1.2方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)，設(shè)計(jì)URG11siRNA干擾序列片段及反密碼鏈（由sigma公司提供）、通過(guò)通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)篩選最合適的U

5、RG11siRNA及抑制適合濃度。
　　根據(jù)文獻(xiàn)我們?cè)O(shè)計(jì)URG11siRNA干擾片段（3對(duì)），構(gòu)建含URG11siRNA慢病毒質(zhì)粒載體，將慢病毒載體質(zhì)粒與LNCaP細(xì)胞混合培養(yǎng)，用慢病毒質(zhì)粒感染LNCaP細(xì)胞，Real-time-PCR和Western blot鑒定有效的干擾載體及合適濃度。
　　2.培養(yǎng)沉默良好的URG11的前列腺癌細(xì)胞株。
　　利用篩選出URG11siRNA特異性干擾片段的質(zhì)粒感染LNCaP細(xì)胞,用

6、含空載質(zhì)粒體的做對(duì)照，通過(guò)Real-time-PCR和Western blot測(cè)定干擾后URG11基因mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.沉默URG11對(duì)PCa細(xì)胞生物學(xué)行為改變的影響。
　　MTS/CCK-8法檢測(cè)沉默后列腺癌細(xì)胞增殖；FCM檢測(cè)細(xì)胞方法檢測(cè)沉默后生長(zhǎng)周期及凋亡程度；遷移實(shí)驗(yàn)及Transwell小室檢測(cè)沉默后侵襲及轉(zhuǎn)移能力等其他生物學(xué)行為。
　　1.3結(jié)果:
　　1.篩選URG11siRNA特異性

7、干擾片段
　　通過(guò)由 sigma公司提供干擾序列片段及反密碼鏈 SASI-Hs01-00182412、SASI-Hs01-00182413、 SASI-Hs01-0018241和空白UUCUCCGAACGUGUCACGUTT轉(zhuǎn)染URG11高表達(dá)的前列腺癌LNCaP細(xì)胞，利用Real-time-PCR、Western blot及 RNA Structure軟件分析得出三條干擾片段各個(gè)濃度的URG11 mRNA表達(dá)能力顯示：SASI-

8、Hs01-00182413（50nM/ul）對(duì)細(xì)胞URG11 mRNA抑制能力是最高的，△Ct值分別為30.54±0.18、30.24±0.15、430.39±0.24；經(jīng)2-△△Ct法計(jì)算處理，經(jīng)過(guò)與空白組的對(duì)比。LNCaP前列腺癌細(xì)胞中URG11 mRNA表達(dá)抑制率高達(dá)78.25％，經(jīng)方差分析F=952.12。P<0.000，按α=0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三個(gè)干擾片段中SASI-Hs01-00182413（50nM/ul）具有良好

9、的抑制URG11效果，SASI-Hs01-00182413片段干擾效率最高、最穩(wěn)定及最有效濃度50nM/ul。
　　2.培養(yǎng)沉默良好的URG11的前列腺癌細(xì)胞株
　　將篩選的有效 URG11siRNA干擾片段構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 LNCaP細(xì)胞株。Real-time-PCR和WB檢測(cè)沉默后的LNCaP的細(xì)胞株，在LNCaP細(xì)胞URG11 mRNA抑制能力是最高的，△Ct值分別為31.62±0.15、30.76±0.11、31.19±

10、0.18；經(jīng)2-△△Ct法計(jì)算處理，經(jīng)過(guò)與空白組的對(duì)比，LNCaP前列腺癌細(xì)胞中URG11 mRNA表達(dá)抑制率高達(dá)78.72%，在PC3前列腺癌細(xì)胞系抑制率為62.01%。根據(jù)干擾后的抑制效果，篩選的URG11siRNA干擾片段及其濃度復(fù)合我們要求，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后也能很好抑制前列腺癌細(xì)胞，兩個(gè)細(xì)胞系中URG11 mRNA明顯降低，經(jīng)方差分析F=867.28，P<0.000，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比O

11、D值（95.1285/1993.015），通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了沉默內(nèi)源性LNCaP的前列腺癌細(xì)胞株成功建立。
　　3..MTS/CCK-8法檢測(cè)沉默后的LNCaP細(xì)胞增殖
　　通過(guò)MTS/CCK-8法檢檢測(cè)沉默后的LNCaP細(xì)胞，與對(duì)照組比較，從表5中，我們可以判斷出在0h時(shí)LNCaP細(xì)胞對(duì)URG11增殖敏感性，經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn)，t=0.300；p=0.266，按α=0.05,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)過(guò)沉默24h/48h/72h后，表

12、7中經(jīng)過(guò)軟件的計(jì)算，可以經(jīng)過(guò)沉默24h/48h/72h后實(shí)驗(yàn)組的抑制率對(duì)比:7.15%;8.75%;10.75%,對(duì)照組中-0.60%;-0.49%;-0.21%,經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),t值分別為：3.72，p<0.05,按α=0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，通過(guò)比較，證實(shí)了通過(guò)URG11siRNA特異性干擾片段沉默URG11后LNCaP細(xì)胞增殖受到抑制。
　　4.FCM分析沉默后的LNCaP細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡指數(shù)
　

13、　通過(guò)流式細(xì)胞儀分析沉默后LNCaP細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡指數(shù)，與對(duì)照組比較，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染沉默后的前列腺癌細(xì)胞培育48/72h后，實(shí)驗(yàn)組停留在G1期的百分比分別為：64.13%；66.98%，在四倍體G2及最終分裂期M期細(xì)胞百分比：10.38%、8.14%，對(duì)于對(duì)照組分析，停留在G1期的百分比分別為：55.94%；53.39%，在四倍體G2及最終分裂期M期細(xì)胞百分比：11.28%；9.25%，經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),p<0.05,按α=0.05,經(jīng)過(guò)

14、轉(zhuǎn)染沉默后的前列腺癌細(xì)胞培育48/72h后，實(shí)驗(yàn)組在分析軟件上UR+LR細(xì)胞百分比分別為：8.48%；8.83%，對(duì)于對(duì)照組分析，UR+LR細(xì)胞百分比分別為：1.47%；1.55%，經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),t值分別為：6.424；6.357，各組p<0.05,按α=0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在凋亡早晚期分析中，沉默48h后前列腺癌細(xì)胞分別為：2.52%；5.96%，沉默72h后前列腺癌細(xì)胞分別為：2.95%；5.88%，經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),p>0.

15、05,我們可以認(rèn)為無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，通過(guò)流式細(xì)胞儀分分析數(shù)據(jù)可以證實(shí)通過(guò)URG11siRNA特異性干擾片段沉默URG11后LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，LNCaP細(xì)胞凋亡率增加。
　　5.Transwell小室檢測(cè)侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
　　與對(duì)照組比較，經(jīng)過(guò)URG11siRNA干擾片段沉默后前列腺癌細(xì)胞在0h、6h、24h、48h的細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移分別為：423.53±16.16；420.06±8.4；408.47±16.07；39

16、1.46±21.05，對(duì)照組前列腺癌細(xì)胞在0h、6h、24h、48h的細(xì)胞遷移分別為：529.41±12.09；518.48±8.62；451.22±48.19；393.07±15.33；轉(zhuǎn)算為遷移率，實(shí)驗(yàn)組分別為：0.00%；0.82%；3.56%；7.57%，對(duì)照組遷移率分別為0.00%；2.06%；14.77%；25.5%，經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),t值分別為：3.786；5.234；5.681，各組p<0.05,按α=0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

17、意義；經(jīng)過(guò)沉默后的. LNCaP細(xì)胞遷移數(shù)目明顯比對(duì)照組少，經(jīng)過(guò)URG11siRNA轉(zhuǎn)染48h后，6組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中平均遷移數(shù)目為（mean±s.d）：75.17±17.12個(gè)；6組對(duì)照組細(xì)胞中平均遷移數(shù)目為（mean±s.d）：164.33±20.03個(gè)，經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),t值為：6.73，各組p<0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染48h后，6組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中平均穿孔數(shù)目為（mean±s.d）：142.83±10.91個(gè)；6組對(duì)

18、照組細(xì)胞中平均穿孔數(shù)目為（mean±s.d）：234±8.29個(gè)，經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),t值為：4.023.p<0.05，按α=0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)過(guò)沉默后的前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力明顯降低，也證實(shí)了干擾片段的沉默抑制作用。
　　1.4結(jié)論:
　　經(jīng)過(guò)URG11siRNA干擾后沉默的LNCaP細(xì)胞在增殖速度、分裂、侵襲能力下降；加快凋亡；腫瘤生物學(xué)行為改變，證實(shí)URG11siRNA有效性，URG11可能是促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞

19、增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能的潛在基因。
　　1.5本研究的創(chuàng)新之處
　　通過(guò)前期研究，前列腺癌細(xì)胞URG11 mRNA蛋白表達(dá)水與良性前列腺組織有顯著性差異，尚未有文章對(duì)于URG11在前列腺癌生物行為及沉默URG11后的研究，本研究通過(guò)篩選實(shí)驗(yàn)等到URG11siRNA有效有效干擾片段 SASI-Hs01-00182413及有效濃度50nM/ul，擬運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染（慢病毒質(zhì)粒）、Real-time-PCR和Western bl