Parkin介導的線粒體自噬在棕櫚酸鈉誘導下腎小管損傷中的作用.pdf

1、目的：探討脂肪酸介導的腎小管損傷的潛在機制——Parkin介導的線粒體自噬。
　　方法：（1）人體實驗實驗組：早期慢性腎臟病合并高脂血癥患者腎臟標本。病理類型：膜性腎病、IgA腎病。對照組：因外傷手術需切除部分腎臟（無基礎腎臟疾病及不伴高脂血癥）的患者腎臟組織。腎臟組織中Parkin、Beclin1及LC3蛋白表達水平采用免疫組化和免疫熒光染色方法。（2）動物實驗隨機分配20只雄性SD大鼠為兩組：正常對照組（n=10），普通飼料喂

2、養(yǎng)；高脂組（n=10），高脂飼料喂養(yǎng)。12周后檢測血清膽固醇、甘油三酯水平。采用免疫組化、免疫熒光及Western blot技術檢測Parkin、LC3II/I、Beclin1等蛋白表達。（3）細胞實驗體外培養(yǎng)人腎小管上皮細胞（ human proximal tubular epithelial cell line，HK-2），采用慢病毒GFP-LC3（MOI=60）轉染HK-2細胞，使HK-2細胞株穩(wěn)定表達GFP-LC3，用棕櫚酸鈉（

3、一種飽和的脂肪酸）刺激HK-2，采用Western blot及細胞免疫熒光技術來檢測Parkin、Beclin1及LC3在HK-2細胞內的表達；采用MDC檢測細胞內酸性液泡；采用DCFH-DA染色檢測細胞內ROS水平；JC-1技術用于檢測HK-2細胞內線粒體膜電位；采用線粒體示蹤劑(Mitochondria tracer)檢測細胞內線粒體形態(tài)；采用TUNEL檢測凋亡水平。轉染si-Parkin敲低HK-2細胞內Parkin表達，觀察PA

4、處理下HK-2細胞內線粒體膜電位，慢病毒GFP-LC3與線粒體共定位以及細胞凋亡水平。采用氧自由基清除劑Tempol預處理HK-2，檢測棕櫚酸鈉處理組或未處理組細胞內凋亡水平。數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準差（X±s）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件處理，兩組資料比較采用t檢驗，多組資料比較采用單因素方差分析，P值＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：（1）早期慢性腎臟病合并高脂血癥（Chronic kidney disease, C

5、KD）患者腎臟Parkin、Beclin1及LC3蛋白表達較因外傷無腎臟基礎疾病無高脂血癥的對照組患者腎臟中表達明顯增高。（2）高脂喂養(yǎng)組大鼠腎臟Parkin、Beclin1及LC3的表達較正常飲食組明顯增高（p＜0.05）。（3）高脂喂養(yǎng)組血清膽固醇、甘油三酯表達水平較正常飲食組明顯增加（p＜0.05）。（4）PA誘導下HK-2細胞內Parkin、Beclin1及LC3的表達呈劑量依賴性增加, MDC水平、ROS及細胞凋亡較對照組明顯

6、增加，線粒體膜電位下降，GFP-LC3和Parkin的共定位增加, GFP-LC3和線粒體共定位增加，線粒體和Parkin的共定位增加。（5）敲低Parkin表達水平, PA誘導下HK-2細胞內GFP-LC3與線粒體共定位、線粒體膜電位較未敲低組減少，ROS水平及細胞凋亡較siParkin未轉染組明顯增加。（6）采用氧自由基清除劑Tempol抑制細胞內活性氧的堆積，能緩解棕櫚酸鈉誘導的HK-2細胞的凋亡。
　　結論：線粒體自噬通過