自噬在癲癇大鼠海馬損傷中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景: 癲癇是嚴重危害人類健康的慢性腦部疾病之一，我國目前約有900萬癲癇患者，給社會、家庭和個人都帶來了沉重負擔。約有20％～30％的癲癇患者用現(xiàn)有的抗癲癇治療方法不能很好地控制發(fā)作，演變?yōu)殡y治性癲癇，顳葉癲癇是其中最常見的一種類型。近年來，對顳葉癲癇的病因、病理及治療等研究已經(jīng)取得了很大進展，但它的發(fā)病機制仍未完全闡明。顳葉癲癇一個重要的病理變化是海馬硬化，表現(xiàn)為神經(jīng)元脫失和膠質細胞增生。癲癇發(fā)作能造成神經(jīng)元損傷已被廣泛

2、認可，一般認為癲癇發(fā)作可誘導谷氨酸過度釋放，激活谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-asparate，NMDA）受體，觸發(fā)鈣離子向神經(jīng)元內流，激活一氧化氮合酶，產(chǎn)生大量自由基，導致氧化應激損傷，活化多種與細胞死亡相關的蛋白，最終造成神經(jīng)元發(fā)生程序性死亡。目前，癲癇發(fā)作致神經(jīng)元損傷的死亡形式及分子機制仍不十分清楚，對癲癇發(fā)作后的神經(jīng)元保護也缺乏有效手段。 細胞穩(wěn)定狀態(tài)的維持取決于細胞內大分子物質生物合成與代謝的平衡

3、，這一平衡的打破往往導致腫瘤細胞生長或誘導細胞發(fā)生自我調節(jié)以適應環(huán)境。真核細胞存在兩大主要的蛋白質降解途徑-蛋白酶體和溶酶體途徑。自噬作為溶酶體降解途徑的形式之一，對于長壽命蛋白降解和細胞器更新發(fā)揮了必不可少的作用。根據(jù)細胞物質運到溶酶體內的途徑不同，哺乳動物細胞內的自噬主要有三種不同的類型：①巨自噬（macroautophagy），是最幸要的一類自噬；多數(shù)人認為是由內質網(wǎng)來源的單層膜凹陷形成杯狀雙層膜樣的分隔膜，進而完全包繞待降解物形

4、成自噬體，接著與溶酶體融合，自噬體內細胞物質如細胞器被溶酶體酶溶解；該途徑豐要降解不必要的或功能異常的細胞器和蛋白；②小自噬（microautophagy）：是溶酶體的膜直接包裹如長壽命蛋白并在溶酶體內降解；③分子伴侶介導的自噬（Chaperone mediated autophagy，CMA）：胞漿內蛋白結合到分子伴侶后被轉運到溶酶體腔中被溶酶體酶消化。細胞為維持正常的新陳代謝，其生長過程始終都有自噬現(xiàn)象；而自噬的消長受多種因素的影響

5、。在正常情況下，自噬在多數(shù)細胞內都處于一個相當?shù)偷乃?。研究表明氧化應激是自噬重要的誘導因素，作為信號分子活性氧可激活自噬現(xiàn)象。此外，自噬參與細胞的死亡過程，自噬是凋亡之外的第二種程序性細胞死亡方式。 到目前為止，自噬是否參與癲癇誘發(fā)的氧化應激反應，以及在神經(jīng)元程序性死亡中發(fā)揮何種作用；自由基清除劑維生素E對自噬的影響如何；自噬抑制劑渥曼青霉素（wortmannin，WM）是否對癲癇致海馬損傷具有保護作用仍未見報道。本研究建立P

6、ILO（pilocarpine，PILO）誘導的大鼠顳葉癲癇模型，探討癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元損傷后的自噬現(xiàn)象的病理特征；分別應用自由基清除劑維生素E和自噬抑制劑WM抑制劑進行干預，檢測與自噬相關的蛋白和信號分子的變化，探討自噬在大鼠癲癇致海馬損傷中的作用及其分子機制。本研究分三部分。 第一部分:巨自噬在癲癇大鼠海馬損傷中作用的研究及維生素E對巨自噬的調節(jié)作用 目的: 探討PILO誘導大鼠癲癇模型海馬神經(jīng)元損傷的病理

7、特征；研究巨自噬在致癇大鼠海馬組織的變化規(guī)律；探討自由基清除劑維生素E對巨自噬的影響以及神經(jīng)保護作用。 方法: 1.應用腹腔注射的方法建立PILO誘導的大鼠顳葉癲癇模型。實驗動物在檢測自噬活性時分為對照組、PILO致癇2h、8h、16 h、24 h、72 h組；在檢測維生素E對巨自噬抑制作用及對海馬神經(jīng)元保護作用時分為對照組、PILO致病組、維生素E+生理鹽水組及維生素E干預組（維生素E+PILO組）。 2.觀察

8、PILO誘導的顳葉癲癇大鼠的行為學變化，致癇成功率，誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)的潛伏期（注射PILO到發(fā)生癲癇持續(xù)狀態(tài)的時間）和24小時的死亡率；觀察維生素E對癲癇動物行為學的保護作用。 3.應用HE染色、Nissl染色觀察各實驗組大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)目改變 4.應用電鏡觀察各組大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的形態(tài)特征及自噬泡的變化 5.應用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測巨自噬活性指標微管相關蛋白輕鏈3（L

9、C3）Ⅱ/LC3Ⅰ的比例、beclin1在癲癇發(fā)作后不同時程的變化。應用逆轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測beclin1 mRNA在癲癇發(fā)作后不同時程的變化。 6.應用Western blot檢測維生素E對癲癇發(fā)作后巨自噬活性變化的作用 結果: 1.注射PILO后5～30min出現(xiàn)刻板行為：表現(xiàn)為凝視不動、咀嚼、吸鼻或探索行為、濕狗樣震顫、反復頭頸上仰等，隨后出現(xiàn)面肌痙攣、點頭、單側或雙側前肢陣攣、伴直立、

10、跌倒或翻轉，最后可發(fā)展至全身強直痙攣持續(xù)狀態(tài)發(fā)作。本組50只大鼠，有45只出現(xiàn)Ⅲ-Ⅴ級發(fā)作，并最終呈SE（其中存活41只，死亡3只），另外5只未達到Ⅲ級反作。待大鼠出現(xiàn)SE發(fā)作后2h，以安定終止后，大鼠處于抑制與消耗狀態(tài)，反應與活動減少。PILO致癇組15只大鼠14只出現(xiàn)SE，致癇率為93.33％。維生素E干預組的斂癇率為80％，兩組間無顯著性差異。 2.正常大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞結構清晰完整，細胞核結構正常，染色質分布均勻，

11、胞漿內尼氏小體豐富。癲癇發(fā)作后大鼠海馬神經(jīng)元腫脹、排列紊亂，膜破裂，胞漿尼氏小體減少。維生素E干預組大鼠海馬大部分錐體細胞邊緣清晰，形態(tài)正常，僅少量神經(jīng)元染色質凝聚、輪廓模糊。 3.大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)日在癲癇發(fā)作24h（75.5±5.92）后較對照組（110.67±18.56）明顯減少（n=6，P<0.05）；維生素E干預組大鼠CA1區(qū)錐體細胞數(shù)日（94.67±13.03）較PILO組顯著增加（n=6，P<0.05）

12、 4.Western blot研究發(fā)現(xiàn)，大鼠致癇后2h海馬組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及beclin1表達升高（P<0.05），在24 h達高峰（P<0.05），并至少持續(xù)增高到72 h（P<0.05）。 結論: 1.PILO致癇大鼠海馬神經(jīng)元受損明顯、數(shù)目減少，受損神經(jīng)元存在巨自噬激活現(xiàn)象。 2.LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及beclin1表達活性在癲癇發(fā)作后表現(xiàn)出時間依賴性增高，該變化可被維生素E部分抑制

13、。 3.維生素E可減輕癲癇發(fā)作造成的海馬神經(jīng)元損傷，延長致癇潛伏期，提高致癇動物的存活率。 第二部分:分子伴侶介導的自噬在癲癇大鼠海馬損傷中作用的研究及維生素E的調節(jié)作用 目的: 探討PILO致癇大鼠海馬組織分子伴侶介導的自噬（Chaperone mediatedautophagy，CMA）隨時間的變化規(guī)律及維生素E對其的調節(jié)作用 方法: 1.應用腹腔注射的方法建立PILO誘導的大鼠顳葉癲

14、癇模型。實驗動物在檢測CMA活性時分為對照組、PILO致癇2h、8h、16 h、24 h組；在檢測維生素E對CMA抑制作用及對海馬神經(jīng)元保護作用時分為對照組、PILO致癇組、維生素E+生理鹽水組及維生素E干預組（維生素E+PILO組）。 2.溶酶體的分離和溶酶體膜的提取分離：采用速度離心和密度梯度離心的方式。 3.應用Western blot檢測各組大鼠海馬組織溶酶體膜上和溶酶體基質內2a型溶酶體膜相關蛋白（lysoso

15、me-associated membrane protein type2a，LAMP2a）的表達；應用RT-PCR檢測各組大鼠海馬組織LAMP2a的mRNA的水平。 結論: 1.癲癇發(fā)作可誘發(fā)海馬組織CMA明顯激活，但晚于巨自噬約6小時，維生素E能明顯抑制癲癇誘發(fā)CMA的激活。 2.癲癇發(fā)作誘發(fā)的CMA的激活是通過LAMP2a的合成增加來實現(xiàn)的，而不是通過LAMP2a由溶酶體基質 第三部分:Wortman

16、nin抑制癲癇大鼠海馬巨自噬活性及神經(jīng)保護作用的研究 目的: 探討巨自噬抑制劑渥曼青霉素（wortmannin，WM）對PILO致癇大鼠的行為學變化，以及對癲癇大鼠海馬組織巨自噬活性即LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的影響，并且探討了磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）在巨自噬中的作用。 方法: 1.應用腹腔注射的方法建立PILO誘導的大鼠顳葉癲癇模型。實驗動物在檢測自噬活

17、性時分為對照組、PILO致癇2h、8h、16 h、24 h、72 h組；在檢測WM對巨自噬抑制作用及對海馬神經(jīng)元保護作用時分為對照組、PILO致癇24h組及WM干預組（WM+PILO組）。 2.觀察PILO誘導的顳葉癲癇大鼠的行為學變化，致癇成功率，誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)的潛伏期（注射PILO到發(fā)生癲癇持續(xù)狀態(tài)的時間）和24小時的死亡率；觀察WM對癲癇動物行為學的保護作用。 3.應用Western blot檢測各組大鼠海馬組織