HDAC1異常表達對膠質瘤細胞耐藥程度的影響.pdf

1、腦膠質瘤是位于大腦和脊髓膠質細胞發(fā)生癌變后所產生的原發(fā)性顱腦腫瘤，是神經外科常見惡性腫瘤?；瘜W藥物治療是膠質瘤患者手術切除后的重要手段，但因其生長部位具有特殊性以及血腦屏障的作用而嚴重影響化療效果，膠質瘤耐藥性極強等，是膠質瘤化療失敗的主要原因。因此研究化療藥耐藥相關作用機制，尋找耐藥相關靶點對臨床治療有指導意義。HDAC1屬于第一類組蛋白去乙酰化酶，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。本實驗擬建立HDAC1過表達和低表達細胞株，觀察不同水平的HD

2、AC1對膠質瘤細胞U87MG耐藥程度的影響，并探討其作用機制，進一步為提高膠質瘤化療藥敏感性奠定基礎。
　　目的:
　　探討組蛋白去乙酰化酶 HDAC1過表達及低表達對膠質瘤化療藥耐藥程度的影響及其作用機制。
　　方法：
　　第一部分：
　　1. HDAC1穩(wěn)定過表達細胞株U87MG-HDAC1的建立
　　從膠質瘤U87MG細胞中提取總RNA，經過RT-PCR反應，TA克隆，酶切鑒定及基因序列分析鑒定

3、，回收純化HDAC1基因片段，將HDAC1片段與空載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro連接得連接產物pCDH-CMV-MCS-HDAC1-EF1-Puro，轉化stbl3感受態(tài)細胞后提取質粒，細胞293 T包裝病毒，感染U87MG細胞，嘌呤霉素篩選，Western Blot免疫印跡法測定HDAC1表達量，建立HDAC1穩(wěn)定過表達細胞株U87MG-HDAC1及其陰性對照U87MG-Control。
　　2. HDAC1低表

4、達細胞株U87MG-HDAC1-RNAi的建立
　　針對HDAC1目的序列，按照shRNA要求合成oligo DNA，經退火反應形成雙鏈，與GV-248載體進行連接，連接產物經轉化和質粒提取，293T細胞包裝病毒，感染膠質瘤U87MG細胞，嘌呤霉素篩選，Western Blot免疫印跡法測定HDAC1表達量，建立HDAC1穩(wěn)定低表達細胞株U87MG-HDAC1-RNAi及其陰性對照U87MG-NC-RNAi。
　　第二部分：

5、
　　HDAC1過表達和低表達對化療藥耐藥程度的影響
　　將實驗對象分為HDAC1過表達組（U87MG-HDAC1& U87MG-Control）和HDAC1低表達組（U87MG-HDAC1-RNAi& U87MG-NC-RNAi）。分別用VM-26和DDP兩類藥物處理兩組細胞。VM-26藥物作用終濃度分別為：0.1、0.5、2.5和12.5μg/mL；DDP藥物作用終梯度濃度分別為：0.08、0.4、2和10μg/mL。藥

6、物VM-26或DDP作用細胞48 h后，MTT法分別檢測過表達組和下調組細胞存活率的改變；Hoechst/PI雙染法檢兩組凋亡形態(tài)學變化，Western Blot檢測兩組細胞凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3和Bcl-2表達情況。
　　結果：
　　第一部分：
　　1.正確擴增 HDAC1基因編碼區(qū)并包裝過表達慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-HDAC1-EF1-Puro，建立HDAC1穩(wěn)定過表達細胞株，Weste

7、rn blot結果顯示U87MG-HDAC1組中HDAC1蛋白的表達較U87MG-Control組顯著增加（1.148±0.024vs0.580±0.003，P<0.01）。
　　2.正確設計合成HDAC1 shRNA雙鏈結構并包裝低表達慢病毒載體GV248-HDAC1-RNAi，建立HDAC1穩(wěn)定低表達細胞株U87MG-HDAC1-RNAi， Western blot結果顯示U87MG-HDAC1-RNAi組中HDAC1蛋白的表

8、達較U87MG-NC-RNAi組顯著下調（0.705±0.009 vs0.352±0.006，P<0.01）。
　　第二部分：
　　HDAC1的過表達和低表達對藥物處理后耐藥程度的影響
　　MTT細胞活性實驗結果顯示，VM-26和 DDP兩種藥物分別處理后，過表達組（U87MG-HDAC1& U87MG-Control）兩細胞株存活率均呈濃度依懶性地降低；在相同的 VM-26或 DDP各個濃度，U87MG-HDAC1存

9、活率顯著高于U87MG-Control細胞株（P<0.05）；VM-26作用下U87MG-HDAC1的IC50值是U87MG-Control的3.11倍， DDP作用下 U87MG-HDAC1的 IC50值是U87MG-Control的2.60倍。VM-26和 DDP兩藥物分別處理后，低表達組（U87MG-HDAC1-RNAi& U87MG-NC-RNAi）兩株細胞存活率均隨藥物濃度增大而降低；在同一VM-26或DDP濃度下，U87MG

10、-HDAC1-RNAi存活率明顯低于 U87MG-NC-RNAi細胞株（P<0.05）；VM-26作用下 U87MG-HDAC1-RNAi的IC50值是U87MG-NC-RNAi的0.49倍，DDP作用下U87MG-HDAC1-RNAi的IC50值是U87MG-NC-RNAi的0.62倍。
　　Hoechst33258/PI雙染法觀察，VM-26和DDP兩種藥物處理后，過表達組（U87MG-HDAC1& U87MG-Control

11、）兩細胞株均隨濃度增大，凋亡細胞比例增大；在相同的VM-26或DDP各個濃度下，U87MG-HDAC1細胞株凋亡細胞比例顯著低于 U87MG-Control。VM-26和 DDP兩種藥物處理后，低表達組（U87MG-HDAC1-RNAi& U87MG-NC-RNAi）兩細胞株均隨濃度增大，凋亡細胞比例增大；在相同的VM-26或DDP各個濃度下，U87MG-HDAC1-RNAi細胞株凋亡細胞比例顯著高于U87MG-Control-RNAi

12、。
　　Western blot免疫印跡結果顯示，VM-26和DDP兩種藥物處理后，過表達組（U87MG-HDAC1& U87MG-Control）兩細胞株，隨藥物濃度增大，Bax、Caspase-3隨之增大，Bcl-2表達則降低；在相同的VM-26或DDP各個濃度下， U87MG-HDAC1的Bcl-2/Bax值顯著高于U87MG-Control（P<0.05），而Caspase3表達量顯著低于 U87MG-Control（P<

13、0.05）。VM-26和 DDP兩種藥物處理后，低表達組（U87MG-HDAC1-RNAi& U87MG-NC-RNAi）兩細胞株，隨藥物濃度增大，Bax、Caspase-3表達均增強，Bcl-2則降低；在相同的VM-26或DDP各個濃度下，U87MG-HDAC1-RNAi的 Bcl-2/Bax值顯著低于 U87MG-NC-RNAi（P<0.05），而Caspas-3表達量顯著高于U87MG-NC-RNAi（P<0.05）。