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文檔簡介
1、[研究背景與目的]
下腰痛(Low Back Pain)及頸肩痛(Neck pain)作為現(xiàn)代社會(huì)最為常見的疾患之一,嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量。流行病學(xué)調(diào)查顯示大約超過80%的人,一生中有過一次或多次下腰痛或肩頸痛的經(jīng)歷,其中超過15%的人其嚴(yán)重程度需要住院治療才能達(dá)到緩解。作為醫(yī)院門診患者就診的常見病因之一,每年因上述癥狀造成的直接或間接社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前對(duì)于引起下腰痛及頸肩痛主要的病因?qū)W研究顯示,超過40%的下腰痛及2
2、0%的頸肩痛患者主要是由于他們的椎間盤退變(IntervertebralDisc Degeneration,簡稱IDD)及IDD所繼發(fā)的一系列病變導(dǎo)致的。對(duì)于IDD患者而言,目前有效的治療方法離不開外科手術(shù)對(duì)退變椎間盤的切除治療。然而在切除退變椎間盤的同時(shí)需要植入融合器并予螺釘固定,在犧牲患者脊柱活動(dòng)度的同時(shí)給患者經(jīng)濟(jì)上帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。因此,尋找新的椎間盤退變治療或椎間盤再生的方法一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
隨著干細(xì)胞研究領(lǐng)
3、域的發(fā)展,以干細(xì)胞為主的再生醫(yī)學(xué)以及生物治療方法引起學(xué)者廣泛關(guān)注。通過使用干細(xì)胞移植、組織工程移植和改變局部微環(huán)境誘導(dǎo)干細(xì)胞再生等創(chuàng)新的醫(yī)療手段的幫助下,能夠達(dá)到修復(fù)受損的組織、重建病變等目的。目前研究較多的具有組織再生及修復(fù)能力的細(xì)胞中,由于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的獲取相對(duì)容易、分化能力強(qiáng)以及研究較為深入等原因使其成為應(yīng)用最為廣泛而可靠的種子細(xì)胞,是目前再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。以MSC為主的再生醫(yī)學(xué)治療方式有望為椎間盤退變患者帶來手術(shù)
4、以外的另一種治療選擇。但幾乎所有MSC等干細(xì)胞都存在有創(chuàng)采集、分離數(shù)量少、年齡依賴性強(qiáng)及體外擴(kuò)增能力有限等缺點(diǎn)極大限制其臨床應(yīng)用。作為能夠起到治療作用的多能干細(xì)胞,其在人體內(nèi)正常新陳代謝的過程中其數(shù)量會(huì)不斷減少、修復(fù)能力不斷減弱。其次,由于其數(shù)量稀少,在采集與體外擴(kuò)增時(shí)常會(huì)混入非干細(xì)胞的成體細(xì)胞,最終在體外擴(kuò)增及治療中影響干細(xì)胞的純度以及療效。再者,以MSC為主的成體多能干細(xì)胞,其在體外擴(kuò)增的過程中亦會(huì)不斷發(fā)生細(xì)胞衰老(Senescen
5、ce),并在此過程中喪失其多向分化潛能。而在椎間盤退變方面,由于髓核的結(jié)構(gòu)特殊使得其內(nèi)環(huán)境處于低氧且營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的狀態(tài),傳統(tǒng)的MSC移植后成活效率較低。此外,由于髓核體積小、周圍有堅(jiān)固的纖維環(huán)包裹、含水量多等特點(diǎn),使其僅可容納少量的MSC進(jìn)入髓核,極大限制了其治療的效果。綜上所述,對(duì)于椎間盤退變的再生醫(yī)學(xué)治療而言,迫切需要尋找一種易獲取、形狀穩(wěn)定、免疫原性低、修復(fù)效果好的干細(xì)胞替代物來彌補(bǔ)上述的不足。
為了尋找合適的干細(xì)胞替代
6、物,學(xué)者們從干細(xì)胞修復(fù)受損組織或促進(jìn)組織再生的機(jī)理方面進(jìn)行了深入的研究,并發(fā)現(xiàn)MSC不僅通過自身增殖分化替代受損組織,更可以通過旁分泌重要的微環(huán)境調(diào)控物質(zhì)——外泌體(Exosomes)來改變受損組織周圍微環(huán)境,從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)功能,間接實(shí)現(xiàn)修復(fù)治療作用。外泌體(Exosomes)是細(xì)胞通過出芽方式分泌的納米級(jí)(40-120nm)雙層膜結(jié)構(gòu)的囊性小泡。由于其具有如同細(xì)胞膜般的雙層磷脂膜結(jié)構(gòu),因此具有良好的滲透性與穩(wěn)定性
7、,能夠與靶細(xì)胞進(jìn)行融合;其內(nèi)富含細(xì)胞來源的mRNA、miRNA以及蛋白質(zhì)成分,且上述成分能夠在參入靶細(xì)胞后對(duì)靶細(xì)胞的功能及信號(hào)起到重要的調(diào)控作用;由于近乎所有細(xì)胞均會(huì)分析外泌體,而不同細(xì)胞來源外泌體內(nèi)成分差異較大,因此其被認(rèn)為是重要的局部微環(huán)境調(diào)控介質(zhì),同時(shí)也是干細(xì)胞對(duì)諸多臟器修復(fù)起作用的重要成分。目前已有許多文獻(xiàn)報(bào)道MSC來源外泌體具有與MSC相似的功能,如其能夠?qū)p傷的組織進(jìn)行修復(fù)、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等。與單純MSC應(yīng)用相比
8、,MSC外泌體具有諸多的應(yīng)用優(yōu)勢(shì),如性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存、沒有免疫原性、獲取容易且方便改造等諸多優(yōu)勢(shì),為多種疾病的治療提供了新的手段。而具有上述特點(diǎn)的MSC來源外泌體可能成為彌補(bǔ)傳統(tǒng)MSC治療方法在椎間盤退變修復(fù)中的不足的理想替代物。
課題組在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSC來源外泌體能夠顯著促進(jìn)髓核細(xì)胞ECM的合成。作為髓核ECM重要合成酶,CHSY同時(shí)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中。CHSY的功能異常會(huì)導(dǎo)致硫酸軟骨素(CS)的合成減少
9、,其與IDD的發(fā)生亦密切相關(guān)?;谏鲜鰞?nèi)容,我們推測MSC來源的外泌體可能通過激活髓核細(xì)胞ECM合成相關(guān)酶CHSY的表達(dá)來促進(jìn)椎間盤的修復(fù)。
第一部分:間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的分離與鑒定
方法:(1)將將沖洗下來的液體制成單細(xì)胞懸液,經(jīng)過商品化Percoll密度梯度離心劑離心分離和收集有核細(xì)胞,再利用含15%胎牛血清的DMEN培養(yǎng)基重懸管中細(xì)胞進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。(2)利用流式細(xì)胞儀器檢測CD105,CD3
10、4,CD44,CD14,CD90,CD45,CD19等間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá);利用商品化成骨、成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)鑒定。(3)將二代后的MSC細(xì)胞于T75以上培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增。待細(xì)胞達(dá)到90%融合度時(shí)更換低血清培養(yǎng)基,通過每兩天一次收集培養(yǎng)基的方式進(jìn)行連續(xù)收集,利用超速離心機(jī)對(duì)收集的上清液進(jìn)行外泌體體離心純化。(4)通過SDS-PAGE電泳及Western-Blot檢測外泌體中特定的蛋白表達(dá)情況。通過透射電鏡或Nano
11、sight可以分析外泌體的大小、形態(tài)。(5)利用PKH67實(shí)驗(yàn)明確外泌體的融合能力。
結(jié)果:(1)通過8例骨髓收集,成功進(jìn)行骨髓來源MSC原代培養(yǎng)7例,均狀態(tài)良好。(2)流式細(xì)胞學(xué)檢測MSC標(biāo)志物CD105,CD34,CD44,CD14,CD90,CD45,CD19示原代培養(yǎng)MSC符合國際界定MSC指標(biāo)。成骨及成脂誘導(dǎo)后,原代培養(yǎng)MSC顯示出明顯的鈣結(jié)節(jié)及脂肪滴。(3)通過大量培養(yǎng)MSC并收集上清進(jìn)行超速離心,獲得明顯的沉淀并
12、進(jìn)行再次離心純化。(4)通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)收集得到的沉淀物表達(dá)外泌體特異性CD81及CD63,Nanosight及電鏡檢測均顯示收集得到的沉淀為外泌體。(5)利用PKH67染料染色外泌體并加入至MSC中,結(jié)果顯示MSC能夠被外泌體染色,提示收集得到的外泌體具有膜融合能力。
結(jié)論:我們通過骨髓MSC細(xì)胞的原代培養(yǎng)獲得了符合國際標(biāo)準(zhǔn)的骨髓MSC細(xì)胞。對(duì)原代MSC細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增及上清的收集后,利用超速離心的方法能夠得
13、到較為純的外泌體。同時(shí)利用外泌體標(biāo)記物及功能實(shí)驗(yàn)明確收集得到的確為外泌體。
第二部分:間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體對(duì)退變椎間盤的影響
方法:(1)收集30-50年齡段的正常髓核組織進(jìn)行原代培養(yǎng)。(2)利用超速離心后的上清液作為去外泌體上清作組,即對(duì)照組;利用未培養(yǎng)過細(xì)胞的原始培養(yǎng)基通過超速離心作為空白對(duì)照組;利用HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行外泌體的分離,得到的外泌體作為陰性對(duì)照組;而MSC來源外泌體作為實(shí)驗(yàn)組處理原代髓核
14、細(xì)胞。(3)通過加入蛋白定量后不同濃度的上述樣品至髓核細(xì)胞,培養(yǎng)24h后通過PCR、Western Blot以檢測處理后髓核細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)分泌表達(dá)情況。(4)通過加入定量后不同濃度的上述分組樣品至髓核細(xì)胞,培養(yǎng)24h后通過PCR、Western Blot檢測處理后髓核細(xì)胞ECM降解相關(guān)MMP、ADAMTS的表達(dá)情況。(5)同上處理后通過PCR、Western Blot檢測處理后髓核細(xì)胞ECM合成相關(guān)CHSY等酶的表達(dá)情況。
結(jié)
15、果:(1)通過原代培養(yǎng)髓核組織,成功建立體外髓核細(xì)胞系6株。(2)成功收集MSC培養(yǎng)上清分離得到的外泌體、去外泌體上清、原始培養(yǎng)基以及HEK293來源外泌體。(3)分組處理后實(shí)驗(yàn)組髓核細(xì)胞其2型膠原、蛋白聚糖表達(dá)量均高于對(duì)照組及陰性對(duì)照組。(4)分組處理后實(shí)驗(yàn)組髓核細(xì)胞MMP1、MMP2、MMP7表達(dá)較對(duì)照組及陰性對(duì)照組出現(xiàn)顯著下調(diào)。(5)分組處理后實(shí)驗(yàn)組髓核細(xì)胞CHSY1、CHSY2、CHSY3表達(dá)較對(duì)照組及陰性對(duì)照組出現(xiàn)顯著上調(diào)。<
16、br> 結(jié)論:通過原代培養(yǎng)髓核組織獲得正常人髓核細(xì)胞株5株。通過BCA法對(duì)分組樣品進(jìn)行定量,定量后處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)MSC來源外泌體具有上調(diào)髓核細(xì)胞ECM合成酶以及ECM合成的作用,并降低ECM降解酶的表達(dá)。
第三部分:MSC外泌體通過上調(diào)CHSY保護(hù)椎間盤髓核細(xì)胞
方法:(1)利用高通量RNA測序技術(shù)檢測外泌體處理后髓核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化。(2)生物信息學(xué)分析MSC來源外泌體促進(jìn)髓核細(xì)胞ECM合成酶的機(jī)制。(3)利用
17、高通量測序技術(shù)檢測外泌體中的microRNA分子,并篩選與CHSY結(jié)合的椎間盤退變相關(guān)miRNA并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證。(4)過表達(dá)預(yù)測的候選miRNA,研究其對(duì)CHSY以及髓核細(xì)胞ECM分泌的變化。(5)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)明確外泌體內(nèi)microRNA對(duì)CHSY的靶向機(jī)制。
結(jié)果:(1)利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)MSC外泌體處理后髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平基因表達(dá)與對(duì)照組相比存在顯著差異。(2)利用GO分析發(fā)現(xiàn)MSC外泌體能夠
18、顯著影響髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子的改變,提示外泌體促進(jìn)CHSY的表達(dá)可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。(3)利用高通量miRNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)MSC來源外泌體較對(duì)照及HEK293外泌體具有較高的microRNA表達(dá)。(4)靶基因預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)MSC外泌體內(nèi)含有能夠顯著抑制CHSY負(fù)向調(diào)控因子,IL-1以及TNF-α通路下游因子NF-κB的miRNA。(5)靶向?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了MSC外泌體中的候選miRNA能夠直接抑制NF-κB的表達(dá),從而促進(jìn)CHSY降低MMP
19、的表達(dá)。
結(jié)論:利用高通量檢測聯(lián)合生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)了MSC來源外泌體能夠顯著提高髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)路后調(diào)控因子的表達(dá),意味著miRNA等轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子與外泌體促進(jìn)IDD中ECM合成密切相關(guān)。利用高通量miRNA組分析MSC來源外泌體并結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)了一批CHSY抑制性NF-κB的靶向性miRNA,并利用相應(yīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。
小結(jié):
本研究通過探究MSC來源外泌體對(duì)髓核細(xì)胞的作用,利用高
20、通量轉(zhuǎn)錄組及miRNA組學(xué)分析手段,首次發(fā)現(xiàn)了髓核細(xì)胞退變引起的ECM合成酶的降低主要是通過IL/TNF等促炎因子誘導(dǎo)的CHSY靶向性miRNA引起的。我們發(fā)現(xiàn)了miR-194、miR-515在IDD中發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào),而通過功能學(xué)驗(yàn)證明確了上述miRNA確實(shí)能夠引起CHSY表達(dá)的變化,而且上述miRNA還直接受到IL/TNF的調(diào)控。通過上述研究啟發(fā)了關(guān)于CHSY的調(diào)控機(jī)制。在MSC外泌體提高CHSY表達(dá)的發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步針對(duì)外泌體中
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