γδT17細胞在柯薩奇病毒性心肌炎發(fā)病中的作用及其機制.pdf

1、病毒性心肌炎（VIRAL MYOCARDITIS，VMC）是一類由病毒感染引起的以心肌局灶性或彌漫性炎癥為主要特征的臨床常見心血管系統(tǒng)疾病。VMC臨床表現不明顯且缺乏針對性診療手段，因此其真實發(fā)病率被低估。VMC的全球發(fā)病率估計在0.12-12％之間，且發(fā)病呈上升趨勢；我國VMC的發(fā)病率為5%-15%不等。VMC已成為青少年猝死的主要原因之一，占心血管類疾病引發(fā)的青少年猝死病例的4%-20%。VMC的長久不愈容易進展為心臟纖維化、致死性

2、擴張性心肌?。―ILATED CARDIOMYOPATHY，DCM）和心衰。作為影響人類健康的一類重要的心血管類疾病，VMC的發(fā)病機制尚未明確，臨床缺少有效的診療方法。因此，闡明VMC的發(fā)病機制具有重要的理論和實踐意義。引發(fā)VMC的病毒包括腸道病毒、腺病毒、流感病毒、巨細胞病毒等，其中腸道病毒 B3型柯薩奇病毒（COXSACKIEVIRUS B TYPE3，CVB3）感染引起的VMC占30%左右。
　　CVB3為小核糖病毒科無衣殼

3、正鏈RNA病毒。經糞口途徑感染，入血后通過血液循環(huán)進入心臟、胰腺、腦、肝臟、肺、脾臟等，通過柯薩奇-腺病毒受體（Coxsackie-adenovirus receptor，CAR）和輔助受體衰變加速因子（Decay accelerating factor，DAF）感染心肌細胞、胰腺細胞等，導致心肌炎、胰腺炎、肝炎、病毒性腦炎等癥狀，其中病毒性心肌炎較為顯著。CVB3引起的病毒性心肌炎可分為三個階段：（1）急性病毒期；（2）亞急性免疫期；

4、（3）慢性心肌病期。在急性期（0-3天），CVB3在心肌細胞大量復制，造成心肌直接損傷；在亞急性期（4-10天），病毒感染激活心臟局部固有免疫，導致炎癥細胞因子和趨化因子的分泌以及多種免疫細胞的浸潤，這一免疫浸潤在第7-12天達到高峰，即所謂急性心肌炎（acute VMC）；在感染后期，炎癥減輕，啟動組織修復，但炎癥遷延不愈則可能進展至慢性心肌炎和纖維化。由此可見急性VMC有少量病毒直接損傷因素，但主要由心臟局部的免疫細胞浸潤帶來的免疫

5、炎癥損傷所介導。急性VMC期間心臟浸潤細胞主要包括：巨噬細胞、嗜中性粒細胞、T細胞，以及少量B、肥大細胞、樹突狀細胞（dendritic cells，DC）和 NK等。其中巨噬細胞最多，而研究最多的是急性VMC期間Th1和Th17細胞的炎癥功能。上述免疫細胞分泌的炎性細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-17是致VMC最為相關的細胞因子。
　　以往對VMC的研究重點大多集中于適應性免疫應答，特別是Th1、Th17、Tr

6、eg等在VMC發(fā)病中的作用及機制，而針對感染早期的固有免疫研究較少。固有免疫是機體抗感染的第一道防線，發(fā)揮早期非特異抗病原體作用，更重要的是，固有免疫細胞如巨噬細胞和 DC表面或胞內的多種模式識別受體（PRRs）通過識別病原體特定的病原相關分子模式（PAMPs），激活固有免疫信號通路，啟動促炎因子和I型干擾素（IFNα/β）分泌和抗原提呈相關分子（MHC II和B7）高表達，因此固有免疫對于啟動和調控后續(xù)T、B適應性免疫應答格局起關鍵作

7、用。國內外學者陸續(xù)報道了感染早期心臟浸潤的巨噬細胞、NK、γδT細胞功能以及TLR1-TLR9、RIG-1等PRRs介導的固有免疫炎癥作用對于VMC發(fā)生的影響。而我們課題組前期致力于巨噬細胞、TLRs固有免疫信號激活及其效應，發(fā)現CVB3感染早期心臟局部巨噬細胞 M1/M2差異性極化、經由 TLR13等固有免疫信號通路所介導的抗病毒作用及促進炎癥細胞因子作用，在急性 CVB3發(fā)病中扮演非常重要的初始作用。提示固有免疫是闡明VMC發(fā)生發(fā)展

8、機制的重要前沿。
　　在對 VMC的致炎細胞因子研究中，IL-17A無疑是最重要和研究最多的明星分子之一。IL-17細胞因子包括IL-17A至IL-17F及其受體等一系列家族分子，是一種在感染和腫瘤等發(fā)生早期在局部分泌的炎癥細胞因子，發(fā)揮局部促炎作用和組織修復等多種功能。2000年前后的若干報道，陸續(xù)證實促炎細胞因子IL-17A在VMC發(fā)病中發(fā)揮必不可少的作用，IL-17A KO小鼠發(fā)生VMC的幾率和嚴重程度顯著下降，基于IL-1

9、7A是CD4+Th17細胞的主要效應分子，推斷Th17在VMC發(fā)病中扮演重要作用。然而隨著免疫學界對于固有免疫的認識的不斷深入，以及對于固有免疫細胞及功能亞群的不斷發(fā)現，科學家發(fā)現分泌IL-17A的免疫細胞除Th17，還有多種固有免疫細胞和上皮細胞，其中γδT細胞逐漸被認為是IL-17A的一個重要來源。γδT細胞是取用多樣性顯著有限的TCRγ和TCRδ鏈的不同于傳統(tǒng)取用α/β鏈的αβT細胞的隸屬固有免疫的T細胞，通常位于人體的皮膚、粘膜

10、局部和腹腔等部位，發(fā)揮重要的抗感染和抗腫瘤功能。近期在腫瘤免疫領域，在幾種不同的腫瘤如肝癌和腸癌，均報道γδT細胞是腫瘤局部IL-17A的最主要來源，且發(fā)揮促進腫瘤生長轉移的重要作用。在若干感染模型中，γδT細胞則被認為對于局部招募嗜中性粒細胞、清除局部病原體十分重要。這促使我們對IL-17A在VMC發(fā)病中的功能進行重新的深入的認識。通過預實驗，我們首先證實了CVB3感染早期（3天），心臟出現γδT細胞的免疫浸潤，同時證實該群固有免疫細

11、胞的確分泌高水平的IL-17A，提示我們重新深入研究γδT細胞來源的IL-17A在柯薩奇病毒性心肌炎中的功能和意義具有創(chuàng)新性，有助于糾正過去片面認為只有 Th17分泌IL-17A而導致VMC發(fā)生的思路。并對未來基于γδT細胞的VMC免疫治療新策略產生積極的作用。
　　基于以上，我們提出研究的科學假設：作為在急性柯薩奇病毒性心肌炎發(fā)病中扮演關鍵促炎作用的IL-17A，其在心臟局部的來源除了已證實的CD4+Th17外，還有另外一群重要

12、的固有免疫細胞---γδT，且γδT細胞出現在心臟局部的時間早于CD4+Th細胞，則其固有免疫作用特別是分泌IL-17A的作用早于CD4+Th細胞，很可能發(fā)揮更為重要的抗感染和促炎作用，可能是解析急性病毒性心肌炎的發(fā)病機制的一個新途徑和新思路。擬在CVB3感染C57BL/6小鼠的急性心肌炎模型基礎上，首先檢測心臟局部IL-17A的分泌動力學，通過IL-17A KO小鼠證實IL-17A的關鍵作用；隨后通過流式細胞術在CVB3感染早期（3天

13、）和急性期（7天）檢測和確證分泌IL-17A的免疫細胞格局，其中γδT細胞分泌IL-17A的亞群格局；進一步通過TCRδ KO小鼠和Vγ4中和抗體通過清除γδT細胞，直接證明γδT細胞和分泌IL-17A的Vγ4γδT細胞在急性VMC發(fā)病中的作用。最后通過檢測IL-17A通路下游的趨化因子、嗜中性粒細胞浸潤等功能來確認γδT17細胞浸潤心臟局部后的多種促炎機制。
　　第一部分：IL-17A在急性病毒性心肌炎發(fā)病中起關鍵作用
　

14、　一、CVB3小鼠病毒性心肌炎模型的建立
　　以CVB3感染小鼠建立的VMC動物模型與臨床VMC病患特征相似。經劑量摸索，以1~1.5╳103 TCID50的CVB3經腹腔感染C57BL/6雄性小鼠，發(fā)現感染后第3天開始小鼠體重明顯下降，7天體重下降率達20%；且7天小鼠死亡率為30~60%。第7天小鼠心臟石蠟切片H.E染色顯示：正常小鼠心肌細胞完整無炎癥，而 CVB3感染小鼠心臟內呈炎性細胞浸潤和局灶性心肌細胞壞死，提示已成功建

15、立了CVB3感染C57BL/6誘導的急性VMC小鼠模型。
　　二、VMC小鼠心臟內IL-17A分泌的動力學
　　為檢測CVB3感染后IL-17A的水平和變化動力學，在CVB3感染后0-7天，ELISA法檢測了小鼠心臟和腸道各器官的IL-17A及其他炎癥細胞因子的水平。結果發(fā)現：未感染時小鼠各器官內檢測不到IL-17A，而CVB3感染后IL-17A水平在心臟和腸道均顯著增高。同時感染第7天心臟炎癥細胞因子TNFα、IL-6、I

16、FNγ等水平均顯著增高，提示了包括IL-17A在內的炎癥細胞因子在心肌炎發(fā)病中發(fā)揮重要作用。同時CVB3病毒復制水平也在第3天達到高峰。
　　三、IL-17A-/-小鼠在CVB3感染后的心肌炎發(fā)病情況
　　為直接證實IL-17A在急性CVB3心肌炎發(fā)病中的作用，利用IL-17A KO小鼠，經CVB3感染觀察小鼠VMC的發(fā)病情況。結果發(fā)現：與WT小鼠相比，感染第7天IL-17A-/-小鼠體重減輕顯著降低，血清CK-MB水平顯著

17、減少，組化顯示心臟組織中炎性細胞浸潤顯著降低。ELISA證實IL-17A-/-小鼠第7天的TNF-α等顯著降低，IL-17檢測不到；而 IFN-γ水平顯著增加。病毒復制水平有少量增高。提示IL-17A-/-小鼠感染CVB3后心肌炎顯著減輕，IL-17A在急性VMC發(fā)病中確實發(fā)揮非常關鍵的促炎作用。
　　第二部分γδT細胞是VMC小鼠心臟局部IL-17A的重要來源
　　一、CVB3感染急性期心臟局部同時存在CD4+Th和γδT

18、細胞浸潤
　　已知IL-17A的主要細胞來源包括CD4+Th細胞和γδT細胞。為此，在CVB3感染建立的C57BL/6小鼠急性VMC模型中，于0、3、7天分別檢測了兩種免疫細胞在小鼠心臟的浸潤。流式檢測發(fā)現：未感染情況下小鼠心臟內幾乎沒有免疫細胞，而在感染3、7天，心臟組織均可檢測到兩種免疫細胞的顯著增高的浸潤。其中：γδT細胞率先進入心臟，在第4天浸潤達到高峰，比例達到5.35%，而細胞絕對數達到104，顯著高于對照組；而CD4

19、+Th細胞則隨時間進展，浸潤數目不斷增高，于第7天達到高峰，比例達13.4%，數目達106。提示兩種免疫細胞均進入心臟組織發(fā)揮炎癥作用，但動力學有時間差異。
　　二、心臟組織內分泌IL-17A的免疫細胞包括CD4+Th細胞和γδT細胞
　　通過流式細胞術，可將浸潤于心臟組織內的免疫細胞進行表型和功能的分類。以IL-17A陽性細胞設門，再分別檢測其中的CD4+細胞和γδT細胞比例。發(fā)現：CD4+T細胞和γδT細胞均能分泌IL-

20、17A：其中γδT細胞約占60%，而Th17細胞占35%；提示急性VMC發(fā)病中心臟浸潤的兩類免疫細胞均顯著分泌IL-17A，其中γδT細胞分泌IL-17A的水平與CD4+Th17相仿或者更高。
　　三、心臟組織內分泌IL-17A的γδT細胞的亞群及其體內動力學
　　在心臟組織第4天達到峰值的浸潤γδ T細胞中，檢測了兩個主要的γδT細胞亞群Vγ1和Vγ4的比例和特性，發(fā)現：1）急性期（第4天）心臟中γδ T細胞亞群Vγ1和V

21、γ4都有浸潤，且比例相當；2）第4天心臟浸潤γδT細胞中，分泌IL-17A的主要是Vγ4γδT細胞；3）Vγ4γδT細胞和Vγ1γδT細胞在心臟浸潤的動力學相當。
　　綜上，小鼠急性VMC過程中，心臟IL-17A的來源除Th17細胞，固有免疫細胞Vγ4γδT細胞也是重要來源，且分泌IL-17A能力略高于CD4+Th17細胞。在感染早期心臟浸潤的IL-17A+γδ T（Vγ4γδ T亞群）細胞可能在VMC發(fā)病中扮演非常關鍵的作用。<

22、br>　　第三部分：IL-17A+γδT細胞在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用
　　一、以TCRδKO小鼠證實γδT細胞在VMC發(fā)病中的作用
　　首先利用TCRδKO小鼠直接證實γδT細胞在VMC發(fā)病中的作用。以CVB3感染TCRδ KO小鼠，發(fā)現：γδT細胞缺失小鼠VMC發(fā)病顯著降低，心臟炎癥浸潤和損傷顯著減少；心臟局部炎性細胞因子IL-17A、TNF-α和IL-6水平均顯著降低；病毒載量變化不顯著。提示γδT細胞在心肌炎發(fā)病中發(fā)

23、揮重要促炎作用。
　　二、以中和抗體清除IL-17A+Vγ4γδT細胞證實其在VMC發(fā)病中的作用
　　利用特異性Vγ4中和抗體于-5、-1天尾靜脈注射小鼠兩次，清除體內Vγ4γδT細胞，再以CVB3感染檢測急性VMC發(fā)病。結果顯示：1）Vγ4中和抗體清除脾臟和心臟的Vγ4γδT的效率為95%；2）剔除Vγ4γδT細胞后，急性心肌炎顯著減輕，CK-MB值顯著降低；3）心臟微環(huán)境炎癥細胞因子IL-17A、TNF-α、IL-6和I

24、FN-γ水平顯著降低；4）心臟病毒載量在感染第3天非常顯著增加。提示 Vγ4T細胞在急性VMC發(fā)病中發(fā)揮重要的促炎、但抑制毒復制作用。
　　三、過繼轉輸γδT細胞觀察γδT來源的IL-17A對VMC的作用。
　　分別體外培養(yǎng)純度高于60%的正常和IL-17A-/-KO小鼠來源γδT細胞，尾靜脈回輸TCRδKO小鼠，而后感染CVB3，發(fā)現：IL-17A-/-KO小鼠來源γδT細胞輸注的小鼠的VMC的發(fā)病及心肌炎癥顯著減少；提示

25、給TCRδKO小鼠補充回復不能分泌IL-17A的γδT細胞，VMC炎癥顯著減輕。提示γδT在VMC發(fā)病中的重要促炎作用通過IL-17A實現。
　　四、分別清除γδ T、Vγ1、Vγ4γδ T和CD4+Th細胞評價CD4+Th17和γδT細胞對VMC心臟炎癥的貢獻
　　上述研究結果證實Vγ4γδT促進VMC炎癥的作用通過IL-17A實現。然而，我們也證實CVB3感染早期γδT與Th17幾乎以相似規(guī)模浸潤于心臟，并同時分泌IL-

26、17A，則如何評估兩種IL-17A+T細胞在VMC發(fā)病中的作用成為一個重要的但比較困難的科學問題。為此，擬分別以抗γδTCR、Vγ1、Vγ4、CD4四種中和抗體清除體內γδ T、Vγ1、Vγ4和CD4+Th細胞，同期評價CD4+Th17和γδT細胞對VMC心臟炎癥的貢獻。該實驗目前尚在進展中。
　　五、γδT細胞亞群Vγ1、Vγ4的相互調節(jié)作用在VMC發(fā)病中的作用
　　已知γδT兩個主要亞群Vγ1和Vγ4可能分泌不同的細胞因

27、子發(fā)揮相反的調控作用。而前述已證實CVB3感染早期兩種γδT以相似比例同時浸潤于心臟，我們發(fā)現：1）Vγ4主要分泌 IL-17A，而Vγ1則分泌 IFN?，且該能力隨 CVB3感染0-7天顯著增強，接近 CD4+Th1。2）通過 Vγ1中和抗體清除試驗發(fā)現使心肌炎加重（結果未顯示），提示Vγ1γδT在急性VMC發(fā)生中起保護作用。3）發(fā)現Vγ4中和抗體清除體內Vγ4γδT細胞后，導致Vγ1細胞近2倍的代償性增高，提示兩種gδT亞群可互相調

28、節(jié)，后續(xù)試驗仍在進行中。綜上，CVB3感染早期浸潤于心臟的γδT細胞在VMC發(fā)生中起重要的促炎作用，其Vγ4γδ T亞群通過分泌IL-17A促進炎癥而發(fā)揮有害作用；而Vγ1γδT通過分泌IFNγ可能調控Vγ4γδT而起保護功能。
　　第四部分：細胞促進CVB3病毒性心肌炎的機制探討
　　IL-17A可作用于多種細胞表面的IL-17RA受體，發(fā)揮多種效應作用。我們考慮心臟顯著上調的IL-17A，特別是Vγ4γδT17細胞分泌的

29、IL-17A，可能通過調控嗜中性粒細胞的心臟浸潤發(fā)揮后續(xù)的抗病毒和促炎功能。
　　一、γδT17分泌的IL-17A對于靶細胞的趨化因子分泌的上調作用
　　首先檢測了IL-17A對心肌細胞和脾臟細胞的趨化因子分泌的調節(jié)作用。以IL-17A刺激原代心肌細胞和脾臟細胞，RT-PCR法檢測趨化因子的表達，發(fā)現：IL-17A作用的原代心肌細胞顯著上調CXCL1、CXCL2和CXCL3；而脾臟細胞顯著上調 CXCL2和 CXCL3。隨后

30、我們純化了脾臟中的嗜中粒細胞，擬近期以Transwell檢測IL-17A對脾臟嗜中粒細胞的趨化作用檢測其表面CXCR2、CXCR5等受體的表達。目前結果提示心臟局部早期浸潤的IL-17A+γδT細胞分泌的IL-17A，可促進CXCL1、CXCL2和CXCL3趨化因子分泌，從而招募外周免疫細胞趨化到心臟而加劇急性心肌炎。
　　二、γδT17對嗜中性粒細胞心臟浸潤的促進作用
　　IL-17A-IL-17RA通路的另一重要效應是趨

31、化嗜中性粒細胞浸潤及功能的激活。我們檢測了CVB3感染小鼠心臟嗜中性粒細胞浸潤，發(fā)現：1）感染第3、7天均可見脾臟和心臟局部的Ly6G+CD11b+嗜中粒細胞浸潤顯著增加，且感染第3天比例最為顯著。2）已純化脾臟來源嗜中粒細胞，擬進行 Transwell實驗，預期IL-17A及體外培養(yǎng)的IL-17A+γδT細胞，均可有效趨化脾臟嗜中粒細胞和CD4+Th細胞。
　　三、清除γδT17對嗜中性粒細胞心臟浸潤的影響
　　以Vγ4中

32、和抗體作用小鼠體內清除IL-17A+Vγ4γδT細胞，發(fā)現CVB3感染后第3天心臟浸潤的嗜中粒細胞顯著減少5倍，證實心臟局部早期浸潤的IL-17A+γδT細胞分泌的IL-17A，可促進中性粒細胞趨化到心臟發(fā)揮免疫炎癥作用。后續(xù)正在進行心臟浸潤的嗜中粒細胞吞噬和促炎功能的研究。
　　綜上，在CVB3感染導致的急性病毒性心肌炎發(fā)病過程中，本研究創(chuàng)新性提出心臟局部早期浸潤的γδT細胞是IL-17A的重要來源，并在VMC發(fā)病中發(fā)揮關鍵作用

33、。我們通過多種KO小鼠和中和抗體清除試驗，證實CVB3感染7天的急性VMC過程中，γδT細胞和CD4+Th細胞均浸潤進入心臟，分別在第3、7天達到高峰；兩群細胞均分泌IL-17A，但Vγ4γδT細胞早于CD4+Th17細胞進入心臟，且分泌IL-17A的能力高于Th17；體內清除γδT或者Vγ4γδT細胞均可顯著減輕急性心肌炎和心臟炎癥細胞因子水平；γδT細胞的另一個亞群Vγ1γδT細胞同時浸潤于心臟，但通過分泌IFNγ對Vγ4γδT細胞

34、發(fā)揮調控作用。CD4+Th17細胞和Vγ4γδT細胞作為CVB3感染后心臟局部分泌 IL-17A的主要細胞亞群，共同促進了急性VMC的發(fā)生。IL-17+Vγ4γδT細胞促進心肌炎的細胞與分子機制與其上調心肌細胞分泌趨化因子 CXCL1/2/3從而促進嗜中性粒細胞浸潤心臟相關。我們的研究創(chuàng)新性地發(fā)現了IL-17A+Vγ4γδT細胞（γδT17）在急性VMC發(fā)生中扮演重要促炎作用，并初步闡明其效應與IL-17A-IL-17R通路介導的嗜中粒