丁苯酞對糖尿病db-db小鼠認知功能障礙及膽堿能系統和細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)會導致認知功能下降，以學習、記憶能力減退為主要特征，甚至可發(fā)展為癡呆。海馬是參與學習、記憶的重要結構。研究表明海馬中膽堿能系統功能受損與神經元細胞凋亡參與認知功能障礙的發(fā)生。膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase, ChAT)和乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)維持腦內膽堿能神經遞質乙酰膽堿（acetylcholine

2、, ACh）動態(tài)平衡，其活性是評價大腦皮質和海馬功能的標志。在細胞凋亡中，Caspase-3是最關鍵的凋亡執(zhí)行者，Bcl-2是公認的凋亡抑制基因。丁苯酞(L-3-n-butylphthalide, NBP)可改善認知功能障礙，但國內外關于丁苯酞對糖尿病相關的認知功能障礙的影響研究甚少。本研究預防性應用丁苯酞，觀察丁苯酞對糖尿病db/db小鼠海馬神經元組織ChAT、AChE、Caspase-3、Bcl-2表達的影響，并探索糖尿病認知功能障

3、礙的可能發(fā)病機制。
　　方法：
　　1.實驗動物分組
　　實驗動物共24只，其中8只6周齡健康雄性db/m小鼠，作為正常對照組（NC, n=8只），余下的16只6周齡健康雄性小鼠為糖尿病db/db小鼠，將其隨機分為糖尿病對照組（DM-C, n=8只），丁苯酞干預組（DM-NBP, n=8只）。
　　2.藥物干預
　　適應性喂養(yǎng)1周后， DM-NBP組小鼠給予溶于植物油的丁苯酞(120mg/kg/d)灌胃，N

4、C組及DM-C組小鼠給予等量的植物油灌胃，共進行6周。
　　3.一般觀察
　　觀察小鼠的精神狀態(tài)、毛色、進食情況、攝水量及尿量變化情況，每周記錄小鼠體重及血糖變化。
　　4.行為學檢測
　　藥物干預6周后，實驗動物進行水迷宮測試，評價各組小鼠空間學習、記憶能力，連續(xù)5天進行定位航行實驗，記錄小鼠的逃避潛伏期，于第6天進行空間探索實驗，記錄小鼠穿越平臺的次數。
　　5.ELISA法、Real Time PCR

5、、Western Blot檢測
　　空間探索實驗結束后，將小鼠處死，取其海馬組織，應用酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測ChAT和AChE含量。應用熒光定量-聚合酶鏈反應（Real Time Polymerase chain reaction, Real Time PCR）及蛋白免疫印跡反應（Western-Blot, WB）分別檢測海馬組織Caspase-3

6、、Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平。
　　6.統計學方法
　　實驗數據應用SPSS21.0統計軟件進行分析，統計結果以均數?標準差（x?s）表示，應用重復測量方差分析和完全隨機設計的單因素方差分析進行數據分析，兩兩比較應用S-N-K檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。
　　結果：
　　1.一般情況觀察(體重:g血糖:mmol/L)
　　DM-C組和DM-NBP組小鼠毛發(fā)稀疏無光澤，反應遲鈍，出現明顯的多

7、尿、多飲、多食癥狀。NC組小鼠一般情況良好，無上述多尿、多飲、多食癥狀。藥物干預6周后，與NC組比較，DM-C組和DM-NBP組小鼠體重、血糖明顯升高，差異有統計學意義（體重：58.06±2.38,57.34±2.17 vs26.39±1.66；血糖：20.94±1.71,20.03±1.66 vs7.21±0.91, P<0.05）,DM-C組和DM-NBP組小鼠體重和血糖無明顯差異（體重：58.06±2.38 vs57.34±2.1

8、7;血糖:20.94±1.71 vs20.03±1.66, P>0.05）(Table1)。
　　2.行為學測試結果
　　2.1.基礎游泳速度測定結果(cm/s)
　　首先在進行定位航行和空間探索實驗前，測定各組小鼠的基礎游泳速度，為此將小鼠放入泳池中自由游泳60秒,記錄游泳速度，結果顯示NC組、DM-C組和DM-NBP組小鼠基礎游泳速度無明顯差異（138.33±7.40 vs134.70±8.28 vs136.64±

9、7.14, P>0.05）(Fig.1, Table2)。
　　2.2.定位航行實驗結果(s)
　　定位航行實驗第1天，各組小鼠逃避潛伏期無明顯差異（58.06±1.82 vs56.57±2.85 vs58.11±1.57, P>0.05）。第2-5天，DM-C組小鼠逃避潛伏期較NC組明顯延長（P<0.05）(Fig.1, Table3)，而經丁苯酞干預的DM-NBP組與未經干預的DM-C組比較，小鼠的逃避潛伏期顯著縮短，但

10、仍較正常對照組延長，差異有統計學意義（P<0.05）(Fig.2, Table3)。
　　2.3.空間探索實驗結果(次/60s)
　　在空間探索實驗中， DM-C組小鼠穿越平臺次數明顯少于NC組（P<0.05）。然而，丁苯酞干預的DM-NBP組小鼠與未經干預的DM-C組比較顯著增加了穿越平臺次數，但仍少于NC組，差異有統計學意義(P<0.05)(Fig.3, Table4)。
　　三組小鼠穿越平臺次數依次為：NC組>D

11、M-NBP組>DM-C組，差異有統計學意義（7.00±0.76 vs5.13±0.64 vs2.38±0.52, P<0.05）。
　　3.小鼠海馬組織中ChAT和AChE的變化(pg/ml)
　　DM-C組小鼠海馬組織中ChAT含量明顯低于NC組（32.24±4.28 vs104.21±4.50, P<0.05）；然而，經丁苯酞干預6周的DM-NBP組小鼠，與未干預的DM-C組比較，海馬組織ChAT含量顯著增加，差異有統計

12、學意義（49.88±6.05 vs32.24±4.28, P<0.05）(Fig.4, Table5)。
　　與ChAT結果相反，DM-C組小鼠海馬組織AChE含量明顯高于NC組（108.92±5.64 vs58.64±6.71，P<0.05）；有意義的是丁苯酞干預避免了AChE的升高，導致DM-NBP組小鼠海馬組織AChE含量顯著低于DM-C組，差異有統計學意義（83.70±4.95 vs108.92±5.64, P<0.05）

13、(Fig.5, Table6)。
　　4.細胞凋亡相關指標的變化
　　DM-C組小鼠海馬組織中Caspase-3 mRNA和蛋白的表達明顯高于NC組（P<0.05）；經丁苯酞干預6周的DM-NBP組小鼠，與未經干預的DM-C組比較，小鼠海馬組織中Caspase-3 mRNA和蛋白的表達明顯降低，但仍高于NC組，差異有統計學意義（P<0.05）(Fig.6，Fig.8，Fig.10，Table7，Table9)。
　　與

14、Caspase-3結果相反，DM-C組小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA和蛋白表達明顯低于NC組；經丁苯酞干預的DM-NBP組小鼠，與未經干預的DM-C組比較，小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA和蛋白的表達顯著增加，但仍低于NC組，差異有統計學意義（P<0.05）(Fig.7，Fig.9，Fig.10，Table8，Table10)。
　　結論：
　　1.糖尿病db/db小鼠13周齡時學習、記憶能力明顯下降。
　　2.