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文檔簡介
1、自噬又稱為二型細胞死亡(typeⅡcelldeath),是細胞程序性死亡的一種,其特征是自噬體的聚集。自噬體是一種吞入細胞器、細胞質的雙層膜結構,它與溶酶體融合形成自噬溶酶體。在溶酶體酶的作用下,自噬體吞入的細胞成分被降解,該過程具有清除受損細胞器及異常蛋白質的重要作用。遭受過度自體消化的細胞便以凋亡或/和非凋亡的形態(tài)學特征走向死亡。環(huán)境誘因(如饑餓、高溫、氧化應激、激素刺激)或細胞內(nèi)壓力(受損細胞器、變異蛋白質聚集和微生物侵蝕)會激活
2、細胞自噬的信號通道。
自噬與腫瘤密切相關,對腫瘤細胞的作用是雙向的。當腫瘤細胞在長時間饑餓、低氧以及在放療和化療藥物作用下,導致細胞內(nèi)受損細胞器增多、蛋白質氧化、變異或錯誤折疊的蛋白質聚集等情況時,腫瘤細胞通過自噬途徑降解細胞內(nèi)受損的細胞器和異常蛋白,并將所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物重新利用,從而為細胞合成新的結構提供原料,同時避免細胞進入凋亡途徑,維持腫瘤細胞的生存。在臨床上,常表現(xiàn)出對放療和化療的抗性而大大降低了治療效果。但是,過
3、度的自噬可以導致腫瘤細胞自噬性死亡或凋亡。所以,探討自噬對腫瘤細胞增殖、死亡和凋亡的影響,為消除自噬對腫瘤細胞的保護作用、探尋旨在通過干預細胞自噬而起作用的協(xié)同抗腫瘤藥物提供理論依據(jù);為臨床上利用現(xiàn)有的自噬誘導劑或抑制劑作為放、化療的增效藥物提供方法和實驗依據(jù),因此,從事該方面的研究具有重要的理論意義和社會效益。
本實驗以自噬標記蛋白LC3的含量為指標,檢測了中國人常見的喉癌、下咽癌和乳腺癌等實體腫瘤內(nèi)自噬的情況,并且研究
4、了熱休克蛋白HSP70,HSP90在腫瘤中的表達情況以及與腫瘤自噬的關系。結果發(fā)現(xiàn),在所檢測的三種癌組織共25例標本中均表達LC3蛋白,說明在腫瘤細胞中,自噬具有一定的普遍性。對9例下咽癌標本的分析顯示,LC3在腫瘤中心部位的表達量顯著高于正常粘膜部位的表達量。HSP70泛表達于被測的標本中,HSP70在正常粘膜和癌邊緣組織中的表達量要高于癌中心組織的表達量。HSP90在喉癌、下咽癌的中心組織中高表達,正常組織中不表達或表達量很低。在1
5、4例乳腺癌樣本中有12例樣本中HSP90高表達;同時,在9例下咽癌樣本中,可觀察到HSP90表達量與LC3有一定的相關性。
由于實體腫瘤內(nèi)部的細胞往往處于缺血,缺氧以及生長因子供應不足的狀態(tài),容易誘發(fā)腫瘤細胞的自噬,所以我們以缺氧和無血清培養(yǎng)A549人類肺癌細胞的方式,體外模擬實體腫瘤內(nèi)部的環(huán)境,研究了缺氧和無血清培養(yǎng)對A549細胞自噬的影響。結果發(fā)現(xiàn),無血清和氮氣培養(yǎng)7小時后,脫落漂浮和死亡的細胞逐漸增多,未脫落的細胞內(nèi)
6、自噬活性增強,通過消化細胞內(nèi)物質和細胞器等維持細胞的生存,導致細胞體積減小,該結果與在體腫瘤細胞的表現(xiàn)相似。
通過Westernblotting檢測LC3的量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、吖啶橙染色顯示酸性膜泡以及電鏡觀察自噬泡形成等手段,研究了臨床上常用的抗腫瘤化療藥物5-氟尿嘧啶對A549細胞自噬的影響,發(fā)現(xiàn)低濃度(1-10mg/L)5-氟尿嘧啶處理可以誘發(fā)A549細胞產(chǎn)生自噬,高濃度(>10mg/L)5-氟尿嘧啶處
7、理主要導致細胞的死亡。進一步研究證明,5-氟尿嘧啶與常用的自噬抑制劑3-MA共同作用時,抑制細胞增殖的能力比5-氟尿嘧啶單獨作用更強,說明在抑制細胞自噬的情況下,可在一定程度上增強5-氟尿嘧啶抗腫瘤的效果。通過對酸性膜泡的形成時間和協(xié)同效率進行比較,初步發(fā)現(xiàn),5-氟尿嘧啶作用A549細胞的48h內(nèi),酸性膜泡形成最多,而在此時間內(nèi),3-MA對5-氟尿嘧啶的增效作用也最強,表明抑制自噬可以增加5-氟尿嘧啶對A549細胞的殺傷作用。另外,低濃
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