腫瘤細胞自噬與腫瘤細胞抗藥性機理的初步研究.pdf

1、自噬又稱為二型細胞死亡(typeⅡcelldeath)，是細胞程序性死亡的一種，其特征是自噬體的聚集。自噬體是一種吞入細胞器、細胞質的雙層膜結構，它與溶酶體融合形成自噬溶酶體。在溶酶體酶的作用下，自噬體吞入的細胞成分被降解，該過程具有清除受損細胞器及異常蛋白質的重要作用。遭受過度自體消化的細胞便以凋亡或/和非凋亡的形態(tài)學特征走向死亡。環(huán)境誘因（如饑餓、高溫、氧化應激、激素刺激）或細胞內(nèi)壓力（受損細胞器、變異蛋白質聚集和微生物侵蝕）會激活

2、細胞自噬的信號通道。
　　 自噬與腫瘤密切相關，對腫瘤細胞的作用是雙向的。當腫瘤細胞在長時間饑餓、低氧以及在放療和化療藥物作用下，導致細胞內(nèi)受損細胞器增多、蛋白質氧化、變異或錯誤折疊的蛋白質聚集等情況時，腫瘤細胞通過自噬途徑降解細胞內(nèi)受損的細胞器和異常蛋白，并將所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物重新利用，從而為細胞合成新的結構提供原料，同時避免細胞進入凋亡途徑，維持腫瘤細胞的生存。在臨床上，常表現(xiàn)出對放療和化療的抗性而大大降低了治療效果。但是，過

3、度的自噬可以導致腫瘤細胞自噬性死亡或凋亡。所以，探討自噬對腫瘤細胞增殖、死亡和凋亡的影響，為消除自噬對腫瘤細胞的保護作用、探尋旨在通過干預細胞自噬而起作用的協(xié)同抗腫瘤藥物提供理論依據(jù);為臨床上利用現(xiàn)有的自噬誘導劑或抑制劑作為放、化療的增效藥物提供方法和實驗依據(jù)，因此，從事該方面的研究具有重要的理論意義和社會效益。
　　 本實驗以自噬標記蛋白LC3的含量為指標，檢測了中國人常見的喉癌、下咽癌和乳腺癌等實體腫瘤內(nèi)自噬的情況，并且研究

4、了熱休克蛋白HSP70，HSP90在腫瘤中的表達情況以及與腫瘤自噬的關系。結果發(fā)現(xiàn)，在所檢測的三種癌組織共25例標本中均表達LC3蛋白，說明在腫瘤細胞中，自噬具有一定的普遍性。對9例下咽癌標本的分析顯示，LC3在腫瘤中心部位的表達量顯著高于正常粘膜部位的表達量。HSP70泛表達于被測的標本中，HSP70在正常粘膜和癌邊緣組織中的表達量要高于癌中心組織的表達量。HSP90在喉癌、下咽癌的中心組織中高表達，正常組織中不表達或表達量很低。在1

5、4例乳腺癌樣本中有12例樣本中HSP90高表達;同時，在9例下咽癌樣本中，可觀察到HSP90表達量與LC3有一定的相關性。
　　 由于實體腫瘤內(nèi)部的細胞往往處于缺血，缺氧以及生長因子供應不足的狀態(tài)，容易誘發(fā)腫瘤細胞的自噬，所以我們以缺氧和無血清培養(yǎng)A549人類肺癌細胞的方式，體外模擬實體腫瘤內(nèi)部的環(huán)境，研究了缺氧和無血清培養(yǎng)對A549細胞自噬的影響。結果發(fā)現(xiàn)，無血清和氮氣培養(yǎng)7小時后，脫落漂浮和死亡的細胞逐漸增多，未脫落的細胞內(nèi)

6、自噬活性增強，通過消化細胞內(nèi)物質和細胞器等維持細胞的生存，導致細胞體積減小，該結果與在體腫瘤細胞的表現(xiàn)相似。
　　 通過Westernblotting檢測LC3的量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、吖啶橙染色顯示酸性膜泡以及電鏡觀察自噬泡形成等手段，研究了臨床上常用的抗腫瘤化療藥物5-氟尿嘧啶對A549細胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度（1-10mg/L）5-氟尿嘧啶處理可以誘發(fā)A549細胞產(chǎn)生自噬，高濃度(＞10mg/L)5-氟尿嘧啶處

7、理主要導致細胞的死亡。進一步研究證明，5-氟尿嘧啶與常用的自噬抑制劑3-MA共同作用時，抑制細胞增殖的能力比5-氟尿嘧啶單獨作用更強，說明在抑制細胞自噬的情況下，可在一定程度上增強5-氟尿嘧啶抗腫瘤的效果。通過對酸性膜泡的形成時間和協(xié)同效率進行比較，初步發(fā)現(xiàn)，5-氟尿嘧啶作用A549細胞的48h內(nèi)，酸性膜泡形成最多，而在此時間內(nèi)，3-MA對5-氟尿嘧啶的增效作用也最強，表明抑制自噬可以增加5-氟尿嘧啶對A549細胞的殺傷作用。另外，低濃