利用SRAP標(biāo)記、ITS和葉綠體特異序列對(duì)紅花種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)初步分析.pdf

1、紅花(CarthamustinctoriusL.)為菊科紅花屬植物,原產(chǎn)埃及,是一種集食用、藥用、染料和飼料為一體的具有廣泛用途的特種油料經(jīng)濟(jì)作物。對(duì)旱薄地適應(yīng)性很強(qiáng),廣泛種植于中亞、西南亞及地中海地區(qū)。
　　本研究采用來(lái)自新疆地區(qū)的11個(gè)品種、云南地區(qū)的15個(gè)品種以及中部省份的8個(gè)品種共34個(gè)品種的紅花作為供試材料。利用SRAP分子標(biāo)記、核糖體基因ITS序列、葉綠體基因組間隔區(qū)序列以及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同品種基因組值等方法對(duì)34個(gè)

2、品種的紅花在進(jìn)行遺傳多樣性研究。探索紅花基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及品種之間的親緣關(guān)系。研究結(jié)果如下:
　　1、SRAP上游引物25條,下游引物37條,共925對(duì)引物組合,對(duì)云紅0003進(jìn)行擴(kuò)增,共篩選出346對(duì)具有清晰譜帶的引物組合。隨機(jī)選取346對(duì)引物中的40對(duì)引物組合對(duì)34份紅花樣品擴(kuò)增,觀察到572條清晰譜帶,其中212條具有多態(tài)性。SLT_NTsys2.10軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析,遺傳相似系數(shù)(GS)的變化范圍在0.5375和0.941

3、1之間,34個(gè)紅花品種可劃分為主要三個(gè)類群,類群I包含來(lái)自新疆地區(qū)的11個(gè)品種;類群II中包含中部省份的8個(gè)品種以及2個(gè)云南品種;類群III中包含云南省的8個(gè)品種;另外有5個(gè)云南紅花品種因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)而被單獨(dú)劃分開。
　　2、利用33個(gè)不同品種紅花基因組DNA為模板進(jìn)行ITS引物特異性擴(kuò)增。測(cè)序并經(jīng)DNAman軟件編輯后進(jìn)行BLAST同源序列搜索,測(cè)序結(jié)果顯示32個(gè)品種ITS序列總長(zhǎng)為751bp,僅西安紅花和云紅5511分別為75

4、0bp和741bp。對(duì)5.8S序列的長(zhǎng)度分析表明,其長(zhǎng)度均為164bp;32個(gè)品種ITS1序列為308bp,僅云紅5511缺失10bp堿基長(zhǎng)為298bp;32個(gè)品種ITS2序列為279bp,僅西安紅花有1bp堿基缺失,長(zhǎng)度為278bp。紅花品種的ITS序列的插入和缺失突變均較少,保持較高的序列長(zhǎng)度穩(wěn)定性。ClustalW2軟件ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析,33個(gè)紅花品種在遺傳距離大于45.69處可分為三個(gè)大的類群,只有三個(gè)品種被單獨(dú)劃分開,類

5、群II還可進(jìn)一步劃分為兩個(gè)小群。研究還發(fā)現(xiàn)ITS序列在紅花品種當(dāng)中變異較快且類型較多,一些突變位點(diǎn)僅見單個(gè)紅花品種,說(shuō)明這些突變與品種類別有關(guān)。
　　3、RNAstructure軟件預(yù)測(cè)了5.8srRNA、ITS1與ITS2的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu),選取預(yù)測(cè)結(jié)果中自由能最小的構(gòu)型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示5.8srRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守,僅僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)品種的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生一個(gè)短臂的變異;ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)類型分為4種構(gòu)型,其中6個(gè)品種為構(gòu)型I,25個(gè)品

6、種為構(gòu)型II,構(gòu)型III和構(gòu)型IV各有1個(gè)品種。構(gòu)型I、II之間主要為C區(qū)臂環(huán)數(shù)量與長(zhǎng)短的差異。構(gòu)型III在A、B、D、E區(qū)構(gòu)象均有細(xì)微改變,整體與I、II差別不大;構(gòu)型IV改變較大,僅C區(qū)的2條臂較保守,其他區(qū)域與I、II、III有較大差異。在ITS2四種構(gòu)型中,C區(qū)的臂環(huán)結(jié)構(gòu)體現(xiàn)出一定的保守性。ITS1二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)保守,主要分為1種含有31個(gè)品種的主要構(gòu)型以及2種只有單品種的獨(dú)特構(gòu)型。在ITS1二級(jí)結(jié)構(gòu)中,構(gòu)型III發(fā)生較大的改變,

7、其結(jié)構(gòu)中C、D、E區(qū)的構(gòu)象與ITS2結(jié)構(gòu)構(gòu)型I中的B、C、D構(gòu)象相類似,均為一個(gè)短臂結(jié)構(gòu)支撐若干臂環(huán)結(jié)構(gòu)。推測(cè)這種存在于間隔區(qū)的近似于“三葉草”的構(gòu)型可能存在某種構(gòu)象識(shí)別作用,可能與RNA加工過(guò)程中剪接復(fù)合體識(shí)別有關(guān)。故ITS1中構(gòu)型III雖然構(gòu)象改變很大,但由于跟ITS2結(jié)構(gòu)相似,可能與ITS2采用同一剪接復(fù)合體從而完成剪接。
　　ITS序列中5.8srRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的高度保守,與其為編碼序列受到選擇壓力大有關(guān);而ITS1、IT

8、S2序列在40S前體rRNA加工過(guò)程中被剪切掉,這兩段序列的RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)折疊成二級(jí)結(jié)構(gòu),形成rRNA剪接體的識(shí)別區(qū)域,因此ITS在二級(jí)結(jié)構(gòu)上較一級(jí)結(jié)構(gòu)更為保守,預(yù)示著ITS二級(jí)結(jié)構(gòu)也蘊(yùn)含主要的遺傳信息。
　　4、對(duì)紅花葉綠體基因組的petN-psbM間隔區(qū)序列與psbM-trnD間隔區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序,ClustalW2軟件進(jìn)行序列比對(duì)。實(shí)驗(yàn)分析表明34個(gè)品種petN-psbM序列總長(zhǎng)均為655bp,CG含量29.6％-2

9、9.8%,僅在412bp處發(fā)生C-A替換。psbM-trnD序列總長(zhǎng)710bp,CG含量37.2%,序列100%保守。兩種序列差異很小,高度保守。與菊科矢車菊屬、菊屬、蒼術(shù)屬植物petN-psbM序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn)相似度最高為98.63%,最低為89.97%,并且構(gòu)建了菊科屬間植物系統(tǒng)發(fā)生樹。
　　5、通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同品種紅花基因組值大小。對(duì)9個(gè)紅花品種進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)共27個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果顯示9個(gè)紅花品種基因值