核糖體基因區(qū)靶向TALENs與載體的構建及其打靶研究.pdf

1、在我室的基因治療研究中，核糖體基因區(qū)(rDNA)由于其安全性及高效率，一直是我們進行基因打靶的重要目的區(qū)域。我室也已經成功構建多種針對此區(qū)域的非病毒打靶載體—核糖體基因區(qū)靶向載體，這些同源重組載體能攜帶多種治療基因在多種細胞系中成功打靶rDNA區(qū)+5468位點，且外源基因能長期穩(wěn)定地表達。TALEN（Transcription activator-like effector nucleases）是一種嶄新的用于基因編輯的分子生物學工具。

2、利用TALE的序列模塊與內切核酸酶FokI偶聯(lián)，可構建成剪切任意特異DNA序列的核酸內切酶TALEN，從而介導高效率的同源重組。以此核酸酶為剪切工具，或許能進一步提高rDNA區(qū)的打靶效率。而由于TALEN切割內源性DNA后產生的DNA雙鏈斷裂(DSB)通過NHEJ（非同源末端重接）進行修復而產生不可預知突變的概率較高，核糖體基因區(qū)為高拷貝，其TALEN打靶過程中產生的突變會嚴重擾亂基因組，影響細胞的存活及同源重組的效率。近期研究顯示，以

3、核酸酶為基礎的核酸切口酶(Nickase)的應用可有效降低NHEJ引起的突變，促進同源重組。
　　目的：研究特異識別與切割核糖體基因區(qū)5468位點的TALENs及TALE Nickases對rDNA區(qū)同源重組的促進作用。
　　方法：⑴以限制性酶切連接的模塊組裝方法構建rDNA區(qū)5468位點特異性的TALENs;⑵將下游的TALENs中FokI的催化域進行點誘變，使FokI單體失活而形成Nickases;⑶用PCR的方法克隆5

4、468位點約1kb的長同源臂、約600bp的短同源臂體及用于 Southern檢測的探針序列，連接構建為無篩選基因的、用于檢測TALENs對同源重組促進強度的打靶載體F9-Pro;⑷用TALENs及Nickases聯(lián)合F9-Pro及PHmF9打靶HT1080細胞及293T細胞，以定點整合PCR、測序等方法鑒定同源重組。
　　結果：①經過酶切、測序、PCR等方法的鑒定，鑒定結果均符合理論預期，說明成功構建了序列正確的5468位點特異

5、性的TALENs、TALENickase及小型打靶載體F9-Pro質粒;②以TALENs及TALENickases聯(lián)合F9-Pro打靶293T細胞3天后，在未經過克隆篩選的條件下，混合細胞經定點整合PCR的半定量分析發(fā)現了較明顯的同源重組，而并未在單轉F9-Pro的對照組中發(fā)現同源重組;③以TALENs及TALENickases聯(lián)合pHmF9打靶HT1080細胞約半個月后，經克隆篩選及鑒定發(fā)現，突變過的TALENickases組的抗性克