脂質(zhì)體納米探針的構(gòu)建及信號(hào)放大策略在生物分子檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、近年來，在生命分析化學(xué)領(lǐng)域中，對(duì)生物分子的檢測(cè)方法要求越來越高，構(gòu)建對(duì)生物大分子簡(jiǎn)單快速、靈敏精確、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、便捷有效的檢測(cè)策略已成為生命分析科學(xué)領(lǐng)域中研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
　　生物分子信號(hào)放大技術(shù)在各種工具酶和納米磁球等生物材料的基礎(chǔ)上發(fā)展起來，它是一種前沿的分析技術(shù)，被廣泛地應(yīng)用于生物分子的檢測(cè)。血糖儀（PGM）是床邊檢測(cè)儀器（Point-of care testing POCT)的一個(gè)重大突破，它不僅能夠方便地為家庭商購(gòu)獲得，

2、而且檢測(cè)過程還脫離了實(shí)驗(yàn)室的條件和儀器操作。由于它的便攜式“袖珍“尺寸、成本劃算、定量測(cè)定可靠、操作簡(jiǎn)單和即時(shí)得出結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。脂質(zhì)體具有理想的生物相容性和巨大的內(nèi)部空腔，可以包封大量的生物分子設(shè)計(jì)成納米探針。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了以工具酶和納米磁球等為材料的熒光信號(hào)放大策略，并構(gòu)建出以多功能脂質(zhì)體納米探針為基礎(chǔ)的PGM檢測(cè)策略，實(shí)現(xiàn)了生物大分子的靈敏、經(jīng)濟(jì)、精確、便攜檢測(cè)。
　　本論文分別利用PGM檢測(cè)和熒光檢測(cè)兩種檢測(cè)手

3、段，主要以Dam甲基轉(zhuǎn)移酶、磷脂酶D為研究對(duì)象，構(gòu)建了多種新的信號(hào)放大檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了其定量分析。主要內(nèi)容包括：
　　1、基于目標(biāo)物控制脂質(zhì)體“開-關(guān)”的級(jí)聯(lián)放大策略構(gòu)建靈敏精確檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中磷脂酶D的新方法
　　本章主要是基于目標(biāo)物控制脂質(zhì)體（TCGL）“開-關(guān)”的級(jí)聯(lián)放大策略，用PGM對(duì)磷脂酶 D進(jìn)行定量檢測(cè)。首先，我們將葡糖淀粉酶包裹于脂質(zhì)體之中，無需對(duì)葡糖淀粉酶進(jìn)行標(biāo)記，省去了標(biāo)記的復(fù)雜過程，保持了酶的原有生物

4、活性。其次，檢測(cè)過程中使用便攜式定量設(shè)備血糖儀，繞開了對(duì)復(fù)雜儀器的需求以及相應(yīng)的復(fù)雜操作，使我們的方法可以簡(jiǎn)單、靈活地應(yīng)用于原位檢測(cè)。該方法對(duì)磷脂酶 D的檢測(cè)限達(dá)到0.005 U L-1。此外，我們進(jìn)一步在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)磷脂酶D實(shí)行活性檢測(cè)并且做了抑制劑藥物篩選實(shí)驗(yàn)，都取得了很好的效果。
　　2、基于磁球/脂質(zhì)體雜交探針構(gòu)建血糖儀靈敏便攜檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的新方法
　　本章以磁球/脂質(zhì)體雜交探針為基礎(chǔ)，構(gòu)建了一種以PGM為

5、檢測(cè)工具，簡(jiǎn)單便攜、靈敏度高、特異性強(qiáng)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)以及抑制劑篩選的新方法。首先，我們將p1DNA功能化的磁球與p2DNA功能化的包裹葡糖淀粉酶的脂質(zhì)體（GEL）雜交制備磁球-脂質(zhì)體雜交探針。然后，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的存在下，雜交探針被甲基化，進(jìn)一步被對(duì)甲基化位點(diǎn)敏感的限制性內(nèi)切酶Dpn I切割，通過磁分離，脂質(zhì)體從磁球上分離下來。最后，用1％的Triton X-100溶液對(duì)分離下來的脂質(zhì)體進(jìn)行裂解，釋放出葡糖淀粉酶，葡糖淀

6、粉酶將信號(hào)底物淀粉催化水解，產(chǎn)生大量的葡萄糖，隨之用血糖儀對(duì)葡萄糖進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到2.0×10?4 U mL?1。此外，我們進(jìn)一步在人血清中進(jìn)行了Dam甲基轉(zhuǎn)移酶的活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，取得了較好的結(jié)果。
　　3、基于磁性納米顆粒協(xié)同核酸外切酶III輔助的循環(huán)放大構(gòu)建靈敏精確檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的新方法
　　本章構(gòu)建了一種Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)的熒光磁性生物傳感器，這種傳感器基于磁性納米粒子協(xié)同核酸外切酶III輔助的循環(huán)指