呋喃唑酮，呋喃妥因和加替沙星的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附檢測法的建立.pdf

1、隨著現(xiàn)代經濟的迅速發(fā)展，現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)近年來也迅速發(fā)展，由此引起的抗生素的濫用導致的大量藥物殘留已經成為威脅人類健康的嚴重經濟社會問題。硝基呋喃類和氟喹諾酮類藥物是人工合成的廣譜抗生素，因為其價格低廉，效果良好，被廣泛應用于畜禽和水產養(yǎng)殖業(yè)。但是這些藥物的濫用也不可避免的導致大量殘留，對人體產生諸如致癌，致突變等毒副作用，引起細菌耐藥性的增加，還通過環(huán)境和食物鏈的作用間接對人體健康造成潛在危害?，F(xiàn)在很多國家已經規(guī)定了食品中硝基呋喃類和氟喹諾

2、酮類藥物殘留的最高檢出上限。為保障人民身體健康和國家進出口經濟利益，建立方便快速可靠的硝基呋喃類和氟喹諾酮類藥物的殘留檢測方法是非常有必要的。 很多國家已經為此而建立了一些藥物殘留的監(jiān)測方法。包括傳統(tǒng)的儀器法，微生物檢測法和新興的酶聯(lián)免疫檢測法（ELISA）。傳統(tǒng)檢測藥物殘留的儀器分析方法包括HPLC、LC-UV、IC-Ms和LC-MS-MS等。這些方法優(yōu)點是準確、穩(wěn)定、特異性好，可以作為標準方法，但儀器設備昂貴，笨重，需要大量

3、的溶劑，對操作人員要求很高，樣品前處理復雜、費時、費力、不易普及，不適合對大規(guī)模的樣品進行即時檢測。微生物檢測法雖然可以進行大量樣品的即時檢測，但是特異性差，不能進行準確的定性定量分析。酶聯(lián)免疫檢測法（ELISA）克服了以上方法的缺點，是一種快速、靈敏、方便的檢測方法，可以用于大量樣品的即時檢測，有著廣闊的發(fā)展前景。而結合了化學發(fā)光分析的酶聯(lián)免疫檢測法（CL-ELISA），由于有著更高的靈敏度，更寬的線性范圍，成為了酶聯(lián)免疫檢測法的發(fā)展

4、趨勢。本論文旨在建立呋喃唑酮，呋喃妥因和加替沙星的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附檢測法（CL-ELISA）。 對于呋喃唑酮，根據(jù)其結構特點，從其代謝產物（AOZ）出發(fā)制備免疫原和包被抗原。利用混合酸酐法合成的免疫原，先將AOZ先與CBA偶連，衍生為CPAOZ，然后利用混合酸酐法與活化的牛血清白蛋白（cBSA）偶聯(lián)合成了免疫原。將此免疫原免疫新西蘭大白兔制得呋喃唑酮的多克隆抗體。合成免疫原的同時，也利用戊二醛法將AOZ與卵清蛋白（OVA）偶

5、聯(lián)合成了包被抗原。對呋喃唑酮，其抗體用間接競爭化學發(fā)光ELISA法檢測結果如下：IC50是0．8ng/mL，檢測限為0．01ng/mL。該抗體除對CPAOZ的交叉反應率較高外，和其他藥物的交叉率均很小。而傳統(tǒng)的比色ELISA法得到的檢測下限為0．2ng/ml，IC50是2．9ng/mL，與傳統(tǒng)的比色ELISA法相比，化學發(fā)光ELISA法有著更好的靈敏度和檢測下限。用此抗體檢測呋喃唑酮在養(yǎng)殖用水中的添加回收率，批間回收率范圍在83-103

6、％之間，批內回收率范圍在78-113％之間。批間變異系數(shù)在5-27％之間，批內變異系數(shù)在4-18％之間。 對于呋喃妥因，其免疫原和包被抗原的合成方法與呋喃唑酮類似。也是從代謝產物AHD出發(fā)，衍生為CPAHD后，用混合酸酐法與活化的牛血清白蛋白（cBSA）偶聯(lián)合成了免疫原，免疫新西蘭大白兔制得多克隆抗體。用戊二醛法將AHD與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成包被抗原。對呋喃妥因，其抗體用間接競爭化學發(fā)光ELISA法檢測結果如下：IC50為

7、0．85ng/mL，檢測限為0．01ng/mL，而傳統(tǒng)的比色ELISA法得到的檢測下限為0．1ng/ml，IC50是3．2ng/ml。該抗體除對CPAHD的交叉反應比較明顯外，和其他藥物的交叉率均很小。用此抗體檢測呋喃妥因在養(yǎng)殖用水中的添加回收率，批間回收率范圍在93．2-110％之間，批內回收率范圍在87．6-113．5％之間。批間變異系數(shù)在6-19％之間，批內變異系數(shù)在3-16％之間。 對于加替沙星，其免疫原和包被抗原由ED

8、C法制備。其抗體用間接競爭化學發(fā)光ELISA法檢測結果如下：IC50為0．4ng/mL，檢測限為0．01ng/mL，而傳統(tǒng)的比色ELISA法得到的檢測下限為0．05ng/ml，IC50是2．6ng/mL。該抗體與其他氟喹諾酮類藥物的交叉反應均很小。用此抗體檢測加替沙星在牛奶樣品中的添加回收率，批間回收率范圍在93-103％之間，批內回收率范圍在89-105％之間。批間變異系數(shù)在5-16％之間，批內變異系數(shù)在4-10％之間。 通過