甘藍型油菜隱性雜合兩型系SLAB育性候選基因的篩選鑒定.pdf

1、甘藍型油菜是世界上重要的油料作物，利用隱性雄性不育授粉系統(tǒng)制備強優(yōu)勢雜交種是甘藍型油菜育種的重要內(nèi)容。本研究通過石蠟切片和掃描電鏡對甘藍型油菜隱性雜合兩型系SLA和SLB花藥發(fā)育的特點進行細胞學分析，初步確定不育系SLA發(fā)生敗育的類型和時期。利用NGS技術對兩型系SLA和SLB進行了轉(zhuǎn)錄組和基因組重測序分析，在基因組水平上分析SLA和SLB之間的遺傳變異；用轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR方法篩選在SLA和SLB中的差異表達基因；應用在線分析軟件

2、 Venny比較分析轉(zhuǎn)錄組差異表達基因和重測序發(fā)生變異的基因，確定與花藥敗育相關的候選基因。其主要結果如下：
　　掃描電鏡分析結果顯示：不育系SLA的花藥顯著小于可育系SLB，整個發(fā)育過程花藥無明顯的伸長生長。當花蕾大小為2mm時，不育系 SLA和可育系 SLB花藥表層細胞無顯著差異；花蕾大小為4mm時，不育系 SLA花藥表層細胞開始塌陷萎縮，背面細胞排列緊密；當花蕾開放后，不育系SLA花藥細胞完全萎縮、退化，花粉囊不能正常開裂釋

3、放花粉。不同發(fā)育期花蕾石蠟切片甲苯胺藍染色的細胞學結果顯示：在四分體時期，不育系 SLA和可育系 SLB的花藥存在顯著差異，SLA的絨氈層細胞高度液泡化，不能皺縮、轉(zhuǎn)化為分泌型；隨后在小孢子發(fā)育過程中逐漸降解消失，不能正常發(fā)育為成熟小孢子。因此，不育系SLA發(fā)生敗育主要原因可能是在四分體時期或四分體之前絨氈層細胞的發(fā)育異常而導致。
　　通過對兩型系SLA和SLB花蕾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較分析，共獲得101個在不育材料SLA中顯著上調(diào)表達的

4、差異基因。采用GO功能分類將三個類別中已注釋基因劃分為25個功能類別。101個差異表達基因中，在分子功能方面富集最多，有55個基因發(fā)生富集，主要在離子結合、電子載體活性等能量代謝相關代謝過程；在生物過程方面有44個基因發(fā)生富集，主要在碳水化合物代謝、蛋白水解、抗氧化反應等條目中；在細胞成分方面富集到2個基因，主要在胞外部分的條目中，說明甘藍型油菜育性調(diào)控是一個復雜的生物過程。KEGG代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因僅在苯丙烷代謝途徑中顯著

5、富集，共有4個顯著差異表達基因，包括1個ACOS5基因（BnaC09g10950D）和3個過氧化物酶家族基因（BnaA01g01280D、BnaA07g01880D、BnaC01g02300D），說明苯丙烷代謝途徑在不育系SLA發(fā)生敗育過程中起重要作用。
　　通過對 SLA和 SLB全基因組重測序數(shù)據(jù)比較分析，在整個基因組中檢測到119,863個SNP位點和18,370個Indel變異位點，這些變異位點大部分發(fā)生在基因間或內(nèi)含子等

6、非編碼區(qū)域，在各條染色體上的分布存在差異性。根據(jù)變異位點在參考基因組上對應的基因物理位置，共注釋到影響基因表達或者功能的錯義突變、移碼突變等變異的基因14,705個；同時針對這些變異基因進行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要在核苷結合、碳水化合物衍生物結合、有機物代謝過程通路等條目發(fā)生富集。
　　綜合轉(zhuǎn)錄組和全基因組重測序結果，共檢測到11個育性關鍵差異表達基因，其中3個基因（BnaA03Rf-4、BnaA10Rf-7、BnaC0

7、5Rf-10）存在2種以上位點變異類型。另外，在內(nèi)含子區(qū)域發(fā)生變異的基因有4個（BnaA03Rf-3、BnaA04Rf-5、BnaA10Rf-6、BnaAnnRf-8），發(fā)生同義突變基因2個（BnaA03Rf-4、BnaC03Rf-9），在上游或下游區(qū)域發(fā)生變異的有6個基因（BnaA01Rf-1、BnaA02Rf-2、BnaA03Rf-4、BnaA10Rf-7、BnaC05Rf-10、BnaC07Rf-11）。qRT-PCR結果顯示11