

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、目的:
創(chuàng)傷性脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種嚴重的神經系統(tǒng)疾病,往往會永久性運動以及感覺功能的缺失,目前臨床上尚沒有一種公認、有效的治療藥物。自噬作為一種細胞生理變化的基本過程,對抗細胞所受到的外界不良刺激,從而減少不良刺激對細胞產生的損害。最近的研究表明,在創(chuàng)傷性脊髓損傷的動物模型中,調控細胞自噬可以減少創(chuàng)傷性脊髓損傷引起的脊髓相關細胞損傷,由此認為,調控細胞自噬可以作為治療創(chuàng)傷性脊髓損傷的一
2、個治療靶點。二甲雙胍(Metformin,Met)是目前治療2型糖尿病中應用最廣泛的降糖藥物之一。二甲雙胍降低高血糖的同時,并不會促進內源性胰島素的分泌,也少引起低血糖癥狀。除了有降血糖的作用之外,在中樞神經系統(tǒng)的許多疾病中都發(fā)現(xiàn)具有神經保護作用,例如:缺血性腦損傷、帕金森病、亨廷頓病等等。我們研究結果發(fā)現(xiàn)損傷創(chuàng)傷性脊髓損傷后,自噬流的下游是被阻斷的。而二甲雙胍有助于促進損傷脊髓自噬流的恢復,由此減少脊髓損傷大鼠的凋亡水平并促進其運動功
3、能恢復,進一步研究二甲雙胍的作用機制發(fā)現(xiàn):AMPK參與二甲雙胍促進脊髓損傷大鼠自噬功能的修復。
方法及結果:
⑴采用夾閉方法來制作SD大鼠急性創(chuàng)傷性脊髓損傷動物模型,即用脊髓夾閉器(30g)打擊脊髓T8~10段造成中度脊髓損傷模型。將雌性SD大鼠(220-250g)隨機分為假手術組、SCI組、SCI+Met組,分別在手術后1d,3d,7d,14d,21d,28d進行大鼠下肢運動功能評價,采用BBB行為學評分及斜板實驗
4、對其后肢運動功能進行評價。發(fā)現(xiàn)給予SCI+Met組在1d,3d,7d的BBB評分以及斜板實驗的評分與 SCI組并無顯著差異,而在14d,21d,28d出現(xiàn)了明顯的差異,這說明Met能促進脊髓損傷大鼠下肢運動功能的部分恢復。隨后在術后3d,7d,處死各組實驗大鼠,收集損傷部位為中心長約1cm脊髓節(jié)段作為組織標本分別用石蠟包埋切片 H&E染色、Nissl染色、Western blot、TUNEL、掃描電鏡以及免疫熒光染色等檢測方法。從H&E
5、染色切片上觀察損傷后脊髓的組織結構形態(tài),結果發(fā)現(xiàn)SCI嚴重破壞了大鼠脊髓結構,導致大鼠脊髓局部出血、相關細胞壞死以及組織液化空洞形成,然而 SCI+Met組的損傷脊髓組織出血、核固縮等損傷均比 SCI組明顯減輕,同時還對損傷后脊髓的空洞面積進行了量化計算,結果發(fā)現(xiàn)SCI+Met組的空洞面積占脊髓總面積的比例比SCI組明顯減少,同時差異有統(tǒng)計學意義。根據Nissl染色(神經元細胞的特異性染色)發(fā)現(xiàn),大鼠SCI后神經元數量顯著減少,殘存運動
6、神經元細胞內尼氏小體的數量減少,顏色淡染。而SCI+Met組結果發(fā)現(xiàn)神經元的數量較SCI組的顯著增多,同時殘存運動神經元細胞內尼氏小體的數量較多,顏色深染。為了從蛋白分子水平研究各實驗組大鼠脊髓的凋亡水平,我們利用了Western blot技術對凋亡相關蛋白(cleaved Caspase3、Bax和Bcl-2)進行了檢測,同時還對各組脊髓組織的切片進行了TUNEL染色,結果發(fā)現(xiàn)損傷后的大鼠脊髓的凋亡相關蛋白的表達水平出現(xiàn)了明顯的提高,
7、同時TUNEL染色提示凋亡細胞的數量出現(xiàn)了明顯的升高,然而Met治療后的大鼠脊髓組織的凋亡相關蛋白的表達水平較未治療組有所下降,同時TUNEL染色證實其損傷周圍的脊髓組織的凋亡細胞的數量也出現(xiàn)了下降。由此證明,Met對SCI后大鼠的脊髓的組織結構具有保護作用,同時還能抑制SCI誘導的細胞凋亡的發(fā)生。⑵為了研究SCI后大鼠脊髓自噬水平的變化,我們利用掃描電子顯微鏡對各實驗組的大鼠脊髓進行了自噬囊泡的觀察,并利用Western blot技術
8、以及免疫熒光染色的技術對自噬相關蛋白進行了分析。掃描電子顯微鏡的結果顯示, SCI后自噬囊泡的數量出現(xiàn)了明顯的增加,Western blot以及免疫熒光染色的結果提示自噬相關蛋白(LC3以及beclin-1)的水平出現(xiàn)升高。但是原本應該下降的自噬底物蛋白(P62)以及可以被自噬所降解的泛素化蛋白(Ubiquitinated proteins,Ub)出現(xiàn)了異常的升高,同時Cathepsin D(CTSD)的結果也證明自噬溶酶體的降解功能被
9、抑制。以上矛盾的結果提示我們,SCI后脊髓組織的自噬是被阻斷掉的。然而給予Met治療后,我們發(fā)現(xiàn),雖然自噬上游的相關指標(自噬囊泡的數量以及LC、beclin-1的表達水平)并沒有出現(xiàn)顯著的差異,但是自噬的下游相關指標(P62、Ub的表達水平)出現(xiàn)了顯著的下降,自噬溶酶體的功能(CTSD)也得到了恢復。結合以上研究結果,我們可以認為SCI后大鼠脊髓的自噬水平出現(xiàn)了抑制,但是Met的治療可以一定程度上恢復SCI后的自噬紊亂。⑶為了研究Me
10、t在SCI中的神經保護作用以及抗凋亡作用是否與自噬紊亂的修復有關,我們在動物實驗中,利用氯奎(Chloroquine,CQ)作為自噬流的抑制劑,與Met聯(lián)合使用拮抗Met的促自噬作用。通過BBB行為學評分、斜板實驗、H&E染色、Nissl染色、Western blot等檢測手段對各組實驗大鼠進行了分析。結果發(fā)現(xiàn),SCI+Met+CQ組的運動功能恢復情況和凋亡相關蛋白的水平與SCI組沒有顯著差異。結合以上結果,我們可以認為,Met通過恢復
11、SCI后自噬流的紊亂,從而減少SCI后脊髓組織的結構破壞以及細胞凋亡的發(fā)生。⑷在發(fā)現(xiàn) Met對 SCI誘導的自噬紊亂有保護作用后,為了進一步探索Met潛在的機制。結合相關文獻報道,發(fā)現(xiàn)Met可以激活AMPK信號通路,同時AMPK能夠參與mTOR的調節(jié),而mTOR又是自噬調控的關鍵蛋白,結合本課題實驗,我們發(fā)現(xiàn)SCI后p- AMPK/AMPK表達上調和p- mTOR/mTOR表達下調,這一結果提示脊髓損傷后自噬的上游是激活的,但是對自噬的
12、激活程度相對薄弱,然而 Met治療可以進一步激活自噬的上游。同時,我們在細胞實驗中,還引入了AMPK抑制劑(Compound C)來進一步證實Met是否通過激活AMPK從而抑制mTOR。結果顯示當AMPK被Compound C抑制時,Met對自噬相關蛋白(mTOR以及P70S6K)的磷酸化水平的影響被明顯減弱。在細胞實驗中,我們還利用免疫熒光染色技術,引入bafilmycin A1(Baf A1)在體外進行了細胞自噬流的檢測。最終結果也
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 二甲雙胍
- 二甲雙胍促進食管鱗癌細胞凋亡及其機制.pdf
- 二甲雙胍及生殖
- 二甲雙胍 ppt課件
- 二甲雙胍臨床應用
- 二甲雙胍的歷史及作用機制
- 二甲雙胍抗腫瘤機制研究進展
- 二甲雙胍演講比賽
- 二甲雙胍最佳劑量探討
- 二甲雙胍對高原低氧認知損傷的保護效應及其作用機制的研究.pdf
- 二甲雙胍的研究進展概述
- 二甲雙胍的研究進展剖析
- 二甲雙胍對大鼠焦慮和恐懼行為的作用及機制.pdf
- 鹽酸二甲雙胍緩釋片的研究.pdf
- 復方鹽酸二甲雙胍雙層片的研究.pdf
- 健脾補腎方聯(lián)合二甲雙胍對
- 二甲雙胍項目調研評估報告
- 鹽酸二甲雙胍的衍生化測定及其機理研究.pdf
- 黃芪多糖促進脊髓損傷大鼠運動功能恢復的實驗研究.pdf
- 二甲雙胍對不同脂肪酸水平下大鼠心肌缺血后心功能恢復的影響.pdf
評論
0/150
提交評論