電化學(xué)基因分型及免疫分析方法的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)和核酸是生命體中最重要的兩類(lèi)生物大分子，核酸堿基的突變是誘導(dǎo)許多遺傳病的原因，而各種蛋白質(zhì)在人體內(nèi)含量的變化直接反映了人體新陳代謝情況，已成為疾病診斷的主要依據(jù)。因此，對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的檢測(cè)分析在生命科學(xué)研究和疾病的臨床診斷領(lǐng)域具有十分重要的意義。并且，建立高靈敏的蛋白質(zhì)和核酸分析方法，一直以來(lái)都是分析科學(xué)家們的研究重點(diǎn)之一。電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)由于有靈敏度高、所需儀器簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、易于實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn)，使得以電化學(xué)檢測(cè)為基礎(chǔ)的生物分

2、析技術(shù)具有極其廣闊的應(yīng)用前景。因此，在本研究論文中，我們發(fā)展了幾種電化學(xué)基因分型技術(shù)以及蛋白質(zhì)檢測(cè)方法： (1)建立了一種基于缺口-連接反應(yīng)原理以及表面雜交技術(shù)的電化學(xué)基因分型方法，提出了均相酶介導(dǎo)等位區(qū)分與表面雜交檢測(cè)的分析結(jié)構(gòu)，解決了電化學(xué)界面核酸酶反應(yīng)效率與忠實(shí)性的困難，并實(shí)現(xiàn)了β-地中海貧血基因中-28位點(diǎn)SNP的檢測(cè)。在該方法中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一對(duì)與目標(biāo)檢測(cè)鏈互補(bǔ)的引物探針與目標(biāo)DNA雜交后，形成了一個(gè)在突變位點(diǎn)處有一個(gè)單

3、堿基缺口的雜交體，該雜交體在有與突變點(diǎn)堿基配對(duì)的堿基存在下，能在聚合酶和連接酶的作用下發(fā)生缺口填充和連接，使兩條分離的引物探針連接起來(lái)。當(dāng)連接產(chǎn)物與目標(biāo)DNA解離后，利用在兩條引物探針中預(yù)先設(shè)計(jì)好的兩段互補(bǔ)的堿基序列之間發(fā)生分子內(nèi)雜交而形成具有莖．環(huán)的發(fā)夾狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。該發(fā)夾結(jié)構(gòu)產(chǎn)物能被固定在金電極表面的捕獲探針捕獲到電極表面，這樣，在引物探針中的電活性標(biāo)記物二茂鐵被吸附到電極表面且能極大程度地靠近電極表面，從而產(chǎn)生氧化-還原電流，達(dá)到高

4、靈敏、高選擇性基因分型的目的。 (2)發(fā)展了一種基于等位特異性延伸的電化學(xué)SNP基因分型方法。該方法通過(guò)硫辛酸修飾寡核苷酸探針在金電極表面的自組裝來(lái)構(gòu)建傳感器界面。在當(dāng)引物與模板DNA完全匹配時(shí)，在聚合酶作用下發(fā)生等位特異性延伸反應(yīng)，產(chǎn)生二茂鐵標(biāo)記型產(chǎn)物，當(dāng)延伸產(chǎn)物在與目標(biāo)鏈解離后，在溶液中能發(fā)生分子內(nèi)雜交而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。從而使該產(chǎn)物能特異性地與電極上的捕獲探針雜交。在電化學(xué)檢測(cè)過(guò)程中，在電極上可以檢測(cè)出二茂鐵的特征還原峰，且峰

5、電流大小與目標(biāo)鏈濃度對(duì)數(shù)成線(xiàn)性關(guān)系。而當(dāng)引物末端堿基與模板DNA上的不匹配時(shí)，等位特異性延伸反應(yīng)不能進(jìn)行，捕獲探針與電活性探針在設(shè)定的反應(yīng)溫度下無(wú)法進(jìn)行雜交，因而在電化學(xué)檢測(cè)中，電極上檢測(cè)不出二茂鐵的還原峰。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)SNP的檢測(cè)。并且使用該方法成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)β-地中海貧血基因的-28位點(diǎn)SNP基因分型的檢測(cè)。 (3)制備了一個(gè)以多克隆抗體作為捕獲探針，并以一個(gè)由血小板衍生化生長(zhǎng)因子—BB(platelet—derived gr

6、owth factor BB，PDGF—BB)適體啟動(dòng)的、嵌入有亞甲基蘭電活性物質(zhì)的環(huán)形長(zhǎng)鏈DNA作為檢測(cè)探針的高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器，并利用該傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)PDGF—BB的定量檢測(cè)。首先，PDGF抗體通過(guò)交聯(lián)劑和金電極表面的單層巰基丙酸自組裝膜發(fā)生共價(jià)交聯(lián)而被固定到電極表面。當(dāng)有目標(biāo)分析物PDGF—BB存在時(shí)，固定到電極表面的抗體能特異性地識(shí)別PDGF—BB并與之結(jié)合，從而將目標(biāo)分析物捕獲到電極表面。與此同時(shí)，我們將一個(gè)在5’端含有

7、PDGF適體的引物在聚合酶的作用下沿著一個(gè)單鏈環(huán)形質(zhì)粒DNA模板分子延伸，形成了一個(gè)在5’端含有PDGF適體的環(huán)形雙鏈DNA檢測(cè)探針，并在環(huán)形DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)中嵌入電活性物質(zhì)亞甲基蘭。而環(huán)形檢測(cè)探針的適體部分能夠和被捕獲到電極上的PDGF—BB發(fā)生特異性結(jié)合而將環(huán)形檢測(cè)探針捕獲到電極表面，從而可以使大量的電活性物質(zhì)亞甲基蘭在電極表面發(fā)生富集，產(chǎn)生較強(qiáng)的氧化還原電流。根據(jù)產(chǎn)生的電流的大小可實(shí)現(xiàn)對(duì)PDGF—BB的定量檢測(cè)。PDGF—BB濃度

8、在50 pgmL-1～500 ng mL-1范圍內(nèi)，傳感器的響應(yīng)電流與PDGF—BB濃度有很好的線(xiàn)性相關(guān)性。 (4)建立了一種以微間距插指電極陣列(MGIDEA)為基礎(chǔ)電極，結(jié)合酶的生物催化銀沉積反應(yīng)來(lái)放大分析信號(hào)的高靈敏檢測(cè)前列腺特異性抗原(prostatespecifie antigen，PSA)的電學(xué)式免疫傳感器。該傳感器采用傳統(tǒng)的夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)模式來(lái)完成免疫反應(yīng)：PSA140單克隆抗體作為捕獲抗體通過(guò)和微間距插指電極表

9、面的硅烷化層發(fā)生共價(jià)交聯(lián)被固定到微間隙里面。當(dāng)有目標(biāo)分析物PSA和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)標(biāo)記PSA103單克隆抗體存在的情況下，在電極表面和捕獲抗體一起通過(guò)特異性免疫反應(yīng)形成一個(gè)捕獲抗體PSA140/目標(biāo)分析物PSA/檢測(cè)抗體PSA103—ALP的夾心復(fù)合物。而吸附到電極表面的ALP能夠催化其底物抗壞血酸磷酸酯(AAP)水解并生成相應(yīng)的還原劑抗壞血酸(AA)，AA能使銀增強(qiáng)溶液中的銀離子還原成銀單

10、質(zhì)并沉積到微間距電極表面，導(dǎo)致微間距電極陣列上相鄰兩個(gè)手指導(dǎo)通，從而增加微間距電極的電導(dǎo)率。而根據(jù)歐姆定律，通過(guò)微間距電極的電流和施加到微間距電極上的電壓成線(xiàn)性關(guān)系，且其斜率就代表電導(dǎo)率。因此，根據(jù)用線(xiàn)性?huà)呙璺椒ǖ玫降姆睬€(xiàn)就能很快計(jì)算出微間距電極的電導(dǎo)率并用于PSA的定量分析。當(dāng)PSA濃度在1.0 fg mL-1～1.0 ng mL-1范圍內(nèi)變化時(shí)，檢測(cè)到的導(dǎo)電率與PSA濃度成線(xiàn)性關(guān)系。 (5)提出了一種利用在納米鉑表面進(jìn)行

11、酶催化銅沉積來(lái)抑制鉑催化氫還原活性的原理來(lái)構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器的方法。通過(guò)在聚苯乙烯微孔板上的夾心免疫分析過(guò)程，將ALP標(biāo)記的抗體通過(guò)分析目標(biāo)物人免疫球蛋白G(humanimmunoglobulin G，hIgG)與固定在微孔內(nèi)的捕獲抗體之發(fā)生夾心免疫反應(yīng)，在微孔內(nèi)形成免疫夾心復(fù)合物——捕獲抗體/hIgG/ALP標(biāo)記的抗體，從而將ALP捕獲到微孔內(nèi)。然后利用ALP催化其對(duì)應(yīng)底物AAP水解產(chǎn)生還原劑AA，使酶催化沉積溶液中的Cu2+還原并

12、沉積到玻碳電極上的納米鉑表面上，抑制鉑催化氫還原的活性，從而使鉑表面的氫溶出電位發(fā)生負(fù)移。根據(jù)氫溶出電位發(fā)生負(fù)移的大小可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物hIgG的定量分析。在優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)條件下，氫溶出電位負(fù)移的大小與hIgG的濃度在10 pg mL-1～1.0μg mL-1范圍內(nèi)有很好的線(xiàn)性關(guān)系。 (6)發(fā)展了一種基于納米金介導(dǎo)生物沉積鉑并以鉑催化氫還原伏安法進(jìn)行檢測(cè)的高靈敏電化學(xué)免疫分析新方法。該方法采用夾心免疫分析模式，實(shí)現(xiàn)了hIgG的測(cè)定

13、。首先在聚苯乙烯微孔板中固定羊抗人IgG捕獲抗體，當(dāng)hIgG被捕獲后，ALP標(biāo)記的hIgG抗體修飾的納米金探針通過(guò)與hIgG形成夾心復(fù)合物而結(jié)合在微孔板上。結(jié)合的ALP催化AAP底物水解產(chǎn)生AA，后者在納米金的介導(dǎo)下還原鉑離子沉積于納米金表面。沉積的金屬鉑用王水[V(HNO3)∶V(HCl)=1∶3]溶解并電富集于玻碳電極上。通過(guò)測(cè)定鉑催化氫還原產(chǎn)生的陰極電流，可實(shí)現(xiàn)hIgG的高靈敏分析。催化氫還原電流與hIgG濃度對(duì)數(shù)在100 ng