鑭系離子與八肋游仆蟲中心蛋白相互作用的電化學研究.pdf

1、中心蛋白屬于鈣離子結合蛋白家族成員，在生物體內與天然的Ca2+相結合，并且中心蛋白的許多生物功能受鈣離子調控。長久以來，本課題組一直致力于對鑭系離子和八肋游仆蟲中心蛋白(EoCen)的相互作用研究，利用鑭系離子豐富的光、電、磁性質來研究鈣離子的配位微環(huán)境及成鍵情況。目前使用的研究方法主要集中在：紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。使用這些方法研究發(fā)現(xiàn)：中心蛋白可以與鑭系離子相互作用，例如與Tb3+、Lu3+、L

2、a3+。中心蛋白有4個螺旋-環(huán)-螺旋結構，可結合鑭系離子，分別是位于C端的兩個高親和的結構和位于N端的兩個低親和結構。鑭系離子在EoCen自組裝、與靶蛋白結合過程中發(fā)揮著重要作用。
　　應用電化學方法研究中心蛋白的性質還屬于起步階段，課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)當將P23（截短型EoCen）加入到Eu3+溶液中時有新物種生成（即配合物P23-Eu3+）。在前期研究的基礎上，本文以Eu3+/Eu2+電對在電極上的氧化還原特性為基礎，應用修飾

3、電極進一步研究了N-EoCen與Eu3+的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)：配合物Eu23+-N-EoCen在 EPG、瓊脂糖、DDAB和MWNT/Nafion/GCE上都可以被還原,但是在EPG、瓊脂糖、DDAB上的氧化還原電流極小，MWNT/Nafion/GCE電極則極大地促進了配合物在電極上的電子傳遞，其氧化還原峰電流約為EPG上的5倍。對配合物Eu23+-N-EoCen在MWNT/Nafion/GCE上的氧化還原特性的詳細研究顯示，Eu3+與

4、N-EoCen相互作用生成了2:1的配合物Eu23+-N-EoCen。配合物與電極之間發(fā)生了直接的、準可逆的電子轉移。根據(jù)Laviron的非擴散控制公式，計算得到電化學參數(shù)a，n，ks分別是0.53,2.0和1.85s-1。配合物的式電位在pH5.6～7.4范圍內與pH呈線性關系，表明電極上兩電子的傳遞耦合有兩質子轉移。溶液pH低于5.0時，不再符合線性關系，說明pH<5.0時，Eu3+不再與N-EoCen相互作用。這一結論也被紫外差光

5、譜實驗證實。在EPG電極上除了對Eu3+與N-EoCen的相互作用研究外，對Eu3+與C-EoCen的相互作用也做了相應研究，結果顯示配合物Eu3+-C-EoCen不能在此電極上還原。
　　為了制備中心蛋白修飾電極，首先使用循環(huán)伏安（CV）和電化學阻抗（EIS）法，以鐵氰化鉀為電化學探針，詳細研究了EoCen、N-EoCen和C-EoCen在GC電極上的吸附性質。研究發(fā)現(xiàn)：三者的吸附過程在一定的濃度范圍內都符合Langmuir等溫

6、式。但是三者的吸附等溫線變化趨勢不同。C-EoCen的吸附等溫線有一個平臺，而N-EoCen則出現(xiàn)了兩個吸附平臺，可能對應著兩種吸附過程，EoCen則在達到一個平臺后隨濃度增大而迅速下降。三者不同的吸附行為可能是由于其各自的聚集性質不同引起的。經(jīng)過計算得出的吸附自由能分別是ΔGADS（EoCen）=-50.04 kJ·mol-1;ΔGADS（N-EoCen）=-40.45 kJ·mol-1;ΔGADS’（N-EoCen）=-33.89k

7、J·mol-1;ΔGADS（C-EoCen）=41.95 kJ·mol-1。表明三種蛋白在玻碳電極表面都屬自發(fā)吸附過程，吸附能力順序為EoCen>C-EoCen>N-EoCen。離子強度對中心蛋白吸附性的影響實驗表明，提高離子強度，蛋白吸附能力降低，說明靜電作用在吸附過程中起關鍵作用。電極電勢對中心蛋白的吸附能力基本不影響。為了說明吸附與蛋白結構的關系，本文還以稀土飽和的中心蛋白、牛血清白蛋白（BSA）、CopC蛋白為模型研究了其吸附性

8、質。結果表明稀土飽和的中心蛋白的吸附力弱于空蛋白，與中心蛋白結構相似的富含α螺旋的BSA在GC電極上有較強的吸附性，與中心蛋白結構明顯不同的富含β折疊的CopC則在GC電極上不發(fā)生吸附。說明蛋白的結構對吸附性的影響較大。
　　根據(jù)中心蛋白在玻碳電極上具有的吸附性，將中心蛋白修飾在電極表面制備中心蛋白修飾電極。以鐵氰化鉀為電化學探針，使用CV和EIS法分別對修飾電極上的EoCen，C-EoCen和N-EoCen與Eu3+的相互作用進

9、行了研究。研究表明，隨著Eu3+離子濃度的增加，探針離子的氧化還原峰電流增加，阻抗減小。從CV和EIS滴定曲線都發(fā)現(xiàn)Eu3+與EoCen形成配位比為4:1的配合物，Eu3+與N-EoCen和C-EoCen則生成2:1的配合物。對應于EoCen蛋白四個不同的結合位點出現(xiàn)了四個不同的CV和EIS響應，說明電化學方法可以將EoCen上四個位點明顯區(qū)分。對不同的稀土離子與N-EoCen相互作用研究結果顯示：鑭系離子對N-EoCen的親和力順序為

10、：Gd3+≈Eu3+>La3+>>Ca2+，符合離子勢順序。本文還使用RLS法對稀土離子與中心蛋白的相互作用進行了研究，結果與電化學研究結果一致，但是RLS法不能明確區(qū)分EoCen上四個不等同的結合位點。為了了解本文所使用的電化學方法對其他蛋白的適用性，以BSA為模型蛋白，使用相同的方法對BSA和Eu3+的相互作用進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)鐵氰化鉀探針離子的氧化還原電流也隨Eu3+濃度的增加而增強。經(jīng)過計算得出Eu3+與BSA以1:1相結合，